DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung der DNA-Polymerase Synthese von modifizierten DNA durch Beobachtung der Veränderungen an der Nah-Infrarot-Eindringmittel beschrifteten DNA mittels Gelelektrophorese und Gel-Bildgebung. Acrylamid Gele werden für hochauflösende Bildgebung der Trennung von kurzen Nukleinsäuren verwendet, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von Größe zu migrieren.
Abstract
Für jedes Enzym sind robustere, quantitative Methoden zur Charakterisierung von Einheimischen und veränderter Enzyme erforderlich. Für DNA-Polymerasen kann DNA-Synthese mit einem in-vitro- DNA-Synthese Assay gefolgt von Polyacrylamid Gelelektrophorese charakterisiert werden. Dieser Test soll Synthese der natürlichen DNA und veränderte DNA (M-DNA) zu quantifizieren. Diese Ansätze sind besonders nützlich für die Lösung Oligonukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung, Beobachtung der einzelnen Schritte bei der enzymatischen Oligonukleotid-Synthese ermöglicht. Diese Methoden wurden für die Bewertung von einer Reihe von biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften wie die Messung von stationären Geschwindigkeitskonstanten der einzelnen Schritte der DNA-Synthese, die Fehlerquote der DNA-Synthese und DNA Bindungsaffinität angewendet. Durch die Verwendung modifiziert Komponenten einschließlich aber nicht beschränkt auf, veränderte Nukleosid Triphosphate (NTP), M-DNA und/oder mutierte DNA-Polymerasen, der relative Nutzen der Substrat-DNA-Polymerase, die Paare effektiv ausgewertet werden können. Hier zeigen wir die Probe selbst, einschließlich der Änderungen, die vorgenommen werden müssen, um nicht traditionele Primer-DNA Kennzeichnung Strategien wie Nahinfrarot-Fluoreszent DNA mit der Bezeichnung unterzubringen. Darüber hinaus haben wir entscheidende technische Schritte für Acrylamid Gel Gießen detaillierte und ausgeführt, die häufig lassen sich technisch anspruchsvoll.
Introduction
DNA-Polymerasen führen Sie genaue und effiziente DNA-Synthese und sind unerlässlich, um die Integrität des Genoms. Die Möglichkeit, Hunderte von Nukleotiden pro Sekunde zu synthetisieren, ohne Fehler macht auch DNA-Polymerasen wesentliche Instrumente in der Molekularbiologie und Biotechnologie. Jedoch schränken diese Eigenschaften auch die Anwendungen für M-DNA-Substrate; im Allgemeinen können nicht natürlichen DNA-Polymerasen viele potentiell wertvolle M-DNA-Substrate, wahrscheinlich wegen zu hohen Selektionsdruck gegen die Verwendung von nicht standardmäßigen Substrate in Vivozu synthetisieren. Viele Gruppen entwickelten gerichteten Evolution Ansätze um mutierte DNA-Polymerasen von M-DNA Synthese1a,2,3,4,5fähig zu generieren; Diese Bemühungen haben das biotechnologische Dienstprogramm DNA-6,7,8erweitert.
Die Fähigkeit des mutierten DNA-Polymerasen, M-DNA synthetisieren bewerten wir9,10, und andere11,12,13 RadioButtonList-Steuerelement in Vitro Messungen der DNA Polymeraseaktivität, die in dieser Handschrift beschrieben werden. In diesen Experimenten sind DNA-Polymerasen zusammen mit beschrifteten Grundierung/Vorlage duplex und Nukleosid Triphosphat Substrate inkubierten; die Produkte werden durch Gelelektrophorese bewertet. Je nach spezifischen experimentellen Frage, mutierte DNA-Polymerasen, modifizierte Primer können geänderten Vorlagen oder modifizierte Nukleosid Triphosphate verwendet werden, ermöglicht die systematische biochemische Auswertung der mutierten Enzym-Aktivität.
In der Vergangenheit haben diese Tests auf einem 5′ radioaktive Aufkleber, DNA-Synthese zu verfolgen verlassen; am häufigsten sind 32P und 33P benutzt worden; in der Regel ist das beschriften mit T4 Polynukleotid Kinase11erreicht. Durch die endliche Lebensdauer und relativ hohen Kosten der radioaktiven Etiketten und deren sichere Entsorgung verwendet unsere Fraktion jedoch stattdessen ein Nahinfrarot-Fluorophor synthetische 5′ DNA bezeichnet. Verwenden einen relativ kostengünstige Nahinfrarot-Gel-Imager, haben wir ähnliche Nachweisgrenzen zu früheren Studien, die mit radioaktiven Etiketten (unveröffentlichte Ergebnisse) beobachtet. Wir haben erfolgreich reproduziert, vorbei an Beobachtungen9, und wir haben keinen großen quantitativen Unterschied mit zuvor gemessenen Geschwindigkeitskonstanten (unveröffentlichte Ergebnisse) nicht eingehalten.
Um die Größe der DNA und damit das Ausmaß der DNA-Synthese zu analysieren, setzen wir auf Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Methoden ursprünglich für Sanger-Sequenzierung14 vor dem Aufkommen der Kapillarelektrophorese15entwickelt. Der Abstand der Trennung oder Mobilität kann als ein Maß der Molekulargewicht verwendet werden; Großformat, vertikale Polyacrylamid-Gele können Einzel-Nukleotid-Auflösung, ermöglicht quantitative Beobachtung der DNA Oligonucleotides unterschiedlicher Länge erreichen.
Gemeinsam sind diese Experimente eine robuste Methode zur Charakterisierung der Polymerase. Aufgrund der Zeit ist sensiblen Reaktionen, Vorbereitung und Betreuung notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Weiter, während die Acrylamid-Gel eine äußerst effektive Methode zur Messung der DNA-Synthese, sowie zahlreiche andere DNA Änderungen Reaktionen, mit Einzel-Nukleotid-Auflösung ist, kann es technisch anspruchsvoll sein. Das Protokoll hier wird hoffentlich ermöglichen Benutzern, diese Experimente durchführen, während die häufigsten Fehler zu vermeiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir einen Test zur Charakterisierung der DNA-Polymerase-vermittelten Synthese von M-DNA beschrieben. Von Nah-Infrarot-beschrifteten DNA Zündkapseln und denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese, um unterschiedlich große Oligonukleotide zu lösen, erhalten wir Einzel-Nukleotid-Auflösung auf Oligonukleotide, ermöglicht die präzise Messung der Synthese. Diese Ansätze können verwendet werden, um entweder die gesamte Aktivität des Enzyms (Abschnitt 2.1) messen oder die Michaelis-Menten-Parameter der e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Research Corporation für wissenschaftlichen Fortschritt (Cottrell College Scholar Award #22548) und TriLink Biotechnologien (ResearchReward Grant #G139) unterstützt.
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
Riferimenti
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