Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

Summary

Questo protocollo descrive la caratterizzazione della sintesi di DNA polimerasi di DNA modificato attraverso l'osservazione dei cambiamenti al DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso mediante elettroforesi su gel e gel di imaging. Gel di acrilammide sono usati per l'imaging ad alta risoluzione della separazione degli acidi nucleici breve, che migrano a velocità diverse a seconda delle dimensioni.

Abstract

Per qualsiasi enzima, robusti, quantitativi metodi sono necessari per la caratterizzazione degli enzimi sia nativi che derivati dal. Per le polimerasi del DNA, sintesi del DNA possono essere caratterizzato usando un in vitro del DNA sintesi analisi seguito da elettroforesi in gel di poliacrilammide. L'obiettivo di questo test è quello di quantificare la sintesi di DNA naturale e di DNA modificato (M-DNA). Questi approcci sono particolarmente utili per la risoluzione dei oligonucleotides con risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l'osservazione delle singole fasi durante la sintesi del oligonucleotide enzimatica. Questi metodi sono stati applicati per la valutazione di una matrice di proprietà biochimiche e biofisiche quali la misurazione delle costanti di tasso costante di singoli passaggi della sintesi del DNA, il tasso di errore della sintesi del DNA e affinità di legame del DNA. Utilizzando componenti tra cui, ma non limitatamente a, i trifosfati del nucleoside modificato (NTP), M-DNA, e/o mutante polimerasi del DNA, il relativo programma di utilità di substrato-DNA polimerasi coppie possono essere efficacemente valutate modificati. Qui, abbiamo dettaglio il dosaggio stesso, comprese le modifiche che devono essere fatte per ospitare contrassegno strategie quali DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso del DNA primer non tradizionali. Inoltre, abbiamo dettagliate passi fondamentali tecnici per colata di gel di acrilammide e in esecuzione, che spesso può essere tecnicamente impegnativo.

Introduction

DNA polimerasi eseguire accurata ed efficiente sintesi di DNA e sono essenziali per mantenere l'integrità genomica. La capacità di sintetizzare centinaia di nucleotidi al secondo senza fare errori fa anche strumenti essenziali di DNA polimerasi in biologia molecolare e biotecnologie. Tuttavia, queste proprietà anche limitano le applicazioni per substrati M-DNA; in linea generale, naturale polimerasi del DNA non possono sintetizzare molti potenzialmente preziosi substrati di M-DNA, probabilmente dovuta alla alta pressione selettiva contro l'uso di substrati non standard in vivo. Molti gruppi hanno sviluppato approcci evoluzione diretto per generare la polimera....

Protocol

1. analisi di attività

Nota: ci sono due tipi comuni di saggi che vengono spesso eseguiti per caratterizzare le polimerasi del DNA utilizzando i metodi descritti qui. Essi si differenziano se qualitativamente caratterizzano sintesi complessiva (che comprende numerosi passaggi della sintesi del DNA) o se essi si concentrano quantitativamente su singoli passaggi. Descriviamo qui di seguito i passi necessari per ognuno di questi.
Nota: Poiché l'assemblaggio di materiali è relativamente complessa, per esperimenti di tempo sensibile, è consigliabile che tutti i materiali sono assemblati in anticipo. Le ricette di tutti i componenti critici....

Results

Un'analisi di successo del gel di poliacrilammide di una caratterizzazione qualitativa della attività complessiva (descritto nella sezione 2.1, Figura 1) e della cinetica allo stato stazionario (descritto nella nota in conclusione del punto 2.1, Figura 2) sono mostrati. Un'analisi di infruttuoso del gel di poliacrilammide è anche mostrata (Figura 3).

Discussion

Qui, abbiamo descritto un test per caratterizzare la sintesi di DNA polimerasi-mediata di M-DNA. Utilizzando primer di DNA con etichetta vicino infrarosso, e utilizzando l'elettroforesi del gel di poliacrilammide denaturante per risolvere diverse dimensioni oligonucleotidi, possiamo ottenere risoluzione di singolo nucleotide su oligonucleotidi, consentendo la misurazione precisa di sintesi. Questi approcci possono essere usati per misurare l'attività complessiva dell'enzima (sezione 2.1) o per misurare i parametri di Mic.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris HCl	Promega	H5123
Tris Base	Promega	H5131
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
Acetilato BSA	Promega	PR-R3961
KCl	Sigma	P4504
Ditiotreitolo (i.e. DTT)	Research Products International	D11000
Acido etilendiamminotetraacetico (cioè EDTA) (soluzione 0,5M)	Sigma	03690-100mL
Glicerolo	Sigma	G5516
Formamide	Acros	AC42374-5000
Arancione G	Sigma Aldrich	O3756
Blu di bromofenolo	Fisher Scientific	50-701-6973
dNTP	Fisher Scientific	FERR0191
M-dNTP (riboNTP)	Fisher Scientific	45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTP (tutti gli altri NTP modificati)	TriLink Biotechnologies	primer assortito
1	IDT DNA / TriLink Biotechnologies	Sintesi	personalizzateUtilizziamo il colorante IR700 che può essere acquistato come sintesi personalizzata. Tipicamente acquistiamo gli oligonucleotidi HPLC purificati. La sequenza è 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
modello 1	IDT DNA / TriLink Biotecnologie	Sintesi personalizzate	Di solito acquistiamo gli oligonucleotidi purificati con HPLC. La sequenza è 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCTCTATAGTGAGTCGTATTA
Acrylamide	Research Products International	A11405	38,67% acrilammide e 1,33% bis-acrilammide
Tris/Borato/EDTA (TBE) solido	Research Products International	T22020
Urea ultrapura	Research Products International	U20200
Nastro in gel	CBS Scientific	GT-72-10
Morsetto a molla bianco grande in polipropilene	CBS Scientific	GPC-0001
Persolfato di ammonio (APS)	Fisher Scientific	BP179
Tetrametiletilendiammina (TEMED)	Fisher Scientific	BP15020
Distanziali da 0,75 mm	CBS Scientific	SGS-20-0740A
Set di lastre di vetro dentate 33x42	CBS Scientific	SGP33-040A
Separatore a piastre a cuneo	CBS Scientific	WPS-100
Pettine per elettroforesi su gel	CBS Scientific	SG33-0734
Impianto per elettroforesi su gel	CBS Scientific	SG-400-33
acqua			utilizziamo un sistema Milli-Q da
DNA polimerasi			MilliporeLi prepariamo nel nostro laboratorio utilizzando protocolli pubblicati.