DNA Polymerase aktivitet Assay ved hjælp af nær-infrarødt fluorescerende mærket DNA visualiseret af acrylamid Gel elektroforese
Summary
Denne protokol beskriver karakterisering af DNA polymerase syntese af modificeret DNA gennem observation af ændringer til nær-infrarødt fluorescently mærket DNA ved hjælp af gelelektroforese og gel billeddannelse. Acrylamid geler bruges til høj opløsning billeddannelse af adskillelse af korte nukleinsyrer, der overflyttes til forskellige priser afhængig af størrelse.
Abstract
For enhver enzym er robust, kvantitative metoder nødvendige for karakterisering af både indfødte og manipuleret enzymer. For DNA polymeraser, kan DNA-syntese karakteriseres ved hjælp af en in vitro- DNA syntese assay efterfulgt af polyacrylamid gelelektroforese. Målet med denne analyse er at kvantificere syntese af både naturlige DNA og modificerede DNA (M-DNA). Disse tilgange er især nyttig til at løse oligonukleotider med enkelt nucleotid opløsning, gør det muligt for observation af enkelte skridt under enzymatisk oligonukleotid syntese. Disse metoder er blevet anvendt til vurdering af en række biokemiske og biofysiske egenskaber såsom måling af steady-state sats konstanter af enkelte trin af DNA-syntese, fejlrate på DNA-syntese og DNA bindende affinitet. Ved hjælp af ændret komponenter, herunder, men ikke begrænset til, ændrede nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, og/eller mutant DNA polymeraser, den relative nytte af substrat-DNA polymerase par kan evalueres effektivt. Her, detalje vi analysen, herunder de ændringer, der foretages til at rumme utraditionel primer DNA mærkning strategier såsom nær-infrarødt fluorescently mærket DNA. Desuden, vi har detaljerede afgørende tekniske skridt for acrylamid gel hælde og kører, kan der ofte være en teknisk udfordring.
Introduction
DNA polymeraser udføre præcise og effektive DNA syntese og er afgørende for at opretholde genom integritet. Evne til at syntetisere hundredvis af nucleotider pr. sekund uden at lave fejl gør også DNA polymeraser væsentlige værktøjer i Molekylærbiologi og bioteknologi. Men disse egenskaber også begrænse ansøgningerne om M-DNA substrater; generelt, naturlige DNA polymeraser ikke selv kan syntetisere mange potentielt værdifulde M-DNA substrater, sandsynligvis grund til den høje selektivt pres mod at bruge ikke-standard betalingsnumre substrater i vivo. Mange grupper har udviklet styret evolution metoder til at generere mutant DNA polymeraser i stand til at M-DNA syntese1a,2,3,4,5; disse bestræbelser har udvidet den bioteknologiske nytte af DNA6,7,8.
At evaluere mutant DNA polymeraser evne til at syntetisere M-DNA, vi9,10, og andre11,12,13 typisk bruge in vitro- målinger af DNA polymerase aktivitet, som er beskrevet i dette håndskrift. I disse eksperimenter er DNA polymeraser Co rugede med en mærket primer/skabelon duplex og nucleoside trifosfat substrater; produkterne er evalueret af gelelektroforese. Afhængigt af den specifikke eksperimentelle spørgsmål, mutant DNA polymeraser, modificerede primere, kan modificerede skabeloner eller modificerede nucleoside triphosphates bruges, gør det muligt systematisk biokemiske evaluering af mutant enzymaktiviteten.
Historisk set har har disse assays påberåbt sig en 5′ radioaktivt mærket til at spore DNA syntese; mest almindeligt anvendte 32P og 33P; typisk, mærkning er opnået ved hjælp af T4 polynucleotide kinase11. Men på grund af den begrænsede levetid og relativt høje omkostninger ved radioaktive etiketter og deres sikker bortskaffelse, vores gruppe i stedet bruger en syntetisk 5′ nær-infrarødt fluorophore mærket DNA. Ved hjælp af en relativt lav pris nær-infrarødt gel imager, har vi observeret lignende påvisningsgrænserne for forudgående undersøgelser ved hjælp af radioaktivt etiketter (ikke-offentliggjorte resultater). Vi har med held gengivet forbi observationer9, og vi har ikke observeret nogen store kvantitative forskel med tidligere målte sats konstanter (ikke-offentliggjorte resultater).
For at analysere størrelsen af DNA, og dermed omfanget af DNA-syntese, stoler vi på polyacrylamid gel elektroforese metoder udviklet oprindeligt for Sanger sekventering14 før fremkomsten af kapillær elektroforese15. Afstand af separation eller mobilitet kan bruges som en måling af Molekylær vægt; stort format, lodret polyacrylamidgeler kan opnå enkelt nucleotid opløsning, gør det muligt for kvantitative observation af DNA oligonukleotider af varierende længde.
Kollektivt, er disse eksperimenter en robust metode til polymerase karakterisering. På grund af tid er følsomme karakter af de reaktioner, forberedelse og pleje nødvendigt at opnå reproducerbare resultater. Yderligere, mens acrylamid gel er en meget effektiv måde at måle DNA-syntese, samt talrige andre DNA ændre reaktioner, med en enkelt nukleotid opløsning, det kan være teknisk udfordrende. Protokol her vil forhåbentlig give brugere til at udføre disse eksperimenter samtidig undgå de mest almindelige fejl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi beskrevet en analyse for at karakterisere DNA polymerase-medieret syntesen af M-DNA. Ved hjælp af nær-infrarødt mærket DNA primere, og ved hjælp af denaturering polyacrylamid gelelektroforese for at løse forskellige størrelser oligonukleotider, kan vi få enkelt nucleotid beslutning om oligonukleotider, muliggør præcis måling af syntese. Disse metoder kan bruges til enten måle den samlede aktivitet af enzymet (afsnit 2.1) eller til at måle Michaelis-Menten parametre af enkelte trin (Bemærk følgen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af forskning Corporation for videnskabens fremskridt (Cottrell College Scholar Award #22548) og af TriLink bioteknologi (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
Riferimenti
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. Biochimica. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochimica. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochimica. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
