Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

Summary

Dieses Protokoll zielt darauf ab, beschreiben eine Methode zur Prüfung der Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}– ausgelöst mitochondriale Schwellung des isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y Zellen Schritt für Schritt.

Abstract

Die Produktion von ATP durch Oxidative Phosphorylierung ist die primäre Funktion der Mitochondrien. Mitochondrien in den höheren Eukaryotes auch an cytosolischen Ca^{2 +} Pufferung und die ATP-Produktion in Mitochondrien kann durch intramitochondrial frei Ca^{2 +} Konzentration vermittelt werden. Ca^{2 +} Rückhaltevermögen kann als die Fähigkeit der Mitochondrien, Kalzium in der mitochondrialen Matrix zu behalten. Kumulierte intrazellulären Ca^{2 +} führt zu der Durchlässigkeit der inneren mitochondrialen Membran bezeichnet die Öffnung des mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP), was dazu führt, das Austreten von Molekülen mit einer molekularen Gewicht weniger als 1,5 kDa. Ca^{2 +}-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Hier beschreiben wir zwei Tests untersuchen die Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien ausgelöst. Nach bestimmten Mengen von Ca^{2 +} werden hinzugefügt, können alle Schritte innerhalb eines Tages abgeschlossen und von einer Mikrotestplatte Leser aufgenommen. Somit können diese zwei einfachen und effektiven Assays ergriffen werden, um die Ca^{2 +}bewerten-mitochondriale Funktionen.

Introduction

Mitochondrien sind die zellulären Hauptorgane, fast 95 % der verwendeten in den Säugetier-Zellen durch Oxidative Phosphorylierung ATP zu produzieren. Es wird berichtet, dass die abgesonderten mikromolaren Konzentration von Ca^{2 +} von Mitochondrien, die Anwesenheit von ADP und anorganischem Phosphat ADP zu ATP-Synthese¹phosphorylieren verwendet werden können. Wenn die Konzentration der cytosolischen Ca^{2 +} einen Schwellenwert überschreitet, Mitochondrien können Aufnahme Ca^{2 +} schnell und Ausfluss es langsam. So können die funktionierenden Mitochondrien Zustrom der erhöhten cytosolischen Ca^{2 +}. Irrelevant für die Teilnahme an der Oxidative Phosphorylierung, die mitochondriale Ca^{2 +} auch an der cytosolischen kalziumsignale teilnehmen und aktivieren den mitochondrialen Apoptose-Mechanismus durch Induktion die Eröffnung der mPTP in der inneren mitochondrialen Membran-². Es wurde allgemein anerkannt, dass abnorme Erhöhung der intrazellulären Ca^{2 +} mitochondriale massive Schwellung hervorrufen kann, durch die Eröffnung der mPTP-³. So, dieses Protokoll zielt darauf ab, die Funktion der Mitochondrien zu bewerten, indem Sie die Quantifizierung der mitochondrialen Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}-trigged mitochondriale Schwellung.

Ca^{2 +} Rückhaltevermögen ist das Maß für die Fähigkeit der Mitochondrien zur Aufnahme zytosolischen Kalzium. Mitochondrien können Puffer freie zytosolischen Kalzium und Kalzium-abhängigen zellulären Prozesse zu regulieren, indem Calciumaufnahme in Form von inaktiven Ausscheidungen. Beeinträchtigt Ca^{2 +} Rückhaltevermögen tritt in Stress-Erscheinungen, die mit Energie-Begrenzung und auch Neurodegenerative Krankheiten^4,5. Isolierte Mitochondrien oder Digitonin-permeabilized Zellen eingesetzt werden, um die Ca^{2 +} Rückhaltevermögen zu identifizieren, und die erhöhte Fähigkeit zu akkumulieren Ca^{2 +} durch isolierte Mitochondrien mit dem Additonal Glutamat und Malat erfolgt nicht durch die Mitochondriale Isolierung Verfahren⁶. Eine betitelten Menge an Digitonin sollte verwendet werden, um die Plasmamembranen von verschiedenen Zelltypen permeabilize. Das Hexapotassium Salz der Ca^{2 +}-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff, Ca^{2 +}-sensible Zelle-impermeant Licht-erregbare Sichtanzeige, wurde weit verbreiteten⁷. Ca^{2 +}-Bindung grün fluoreszierenden Farbstoff ist ein Low-Affinität-Indikator und verwendet, um anzuzeigen, dass intrazelluläre freie Ca^{2 +} Konzentrationen im steigen weiter (5 min) Stimulationen⁸verlängert. Diese Methode war weniger empfindlich als die radioaktive Filtertechnik aber wesentlich vereinfacht. Das zusätzliche Ca^{2 +} Kalzium grüne Fluoreszenz erhebt und die Ca^{2 +} Aufnahme von Mitochondrien kehrt die Fluoreszenz Baseline. Fortlaufende Ergänzungen von Ca^{2 +} wurden vorgenommen, bis die Mitochondrien zur Aufnahme Extramitochondrial Ca^{2 + 9}nicht. Ein Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser lässt sich regelmäßig Kalzium grüne Fluoreszenz Berichten.

Nach Ca^{2 +} Akkumulation Mitochondrien depolarisiert, Ca^{2 +} in das Medium abgegeben und begann anzuschwellen. Ca^{2 +}-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Elektronenmikroskopie und die Abnahme der leichten Extinktion bei 540 nm kann verwendet werden, um die Ca^{2 +}Messen-mitochondriale Schwellung^10,11ausgelöst. Mitochondrien Volumen kann direkt durch nach vorne Winkel Lichtstreuung¹², ermittelt werden, wo sinkt in die Extinktion passive Schwellung der mitochondrialen Matrix widerspiegeln.

Hier zeigen wir die Methodik zur Prüfung der mitochondrialen Ca^{2 +} Rückhaltevermögen und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien aus SH-SY5Y Zellen ausgelöst.

Protocol

1. Isolation von Mitochondrien Hinweis: Alle Lösungen und Geräte sollten auf 0 – 4 ° C vorgekühlt und auf Eis gehalten werden. Samen etwa 3 x 106 SH-SY5Y Zellen pro 10 cm Zelle Kulturschale. Zellkulturen in hoch-Glukose Dulbecco modifizierten Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum, Penicillin (100 U/mL)-Streptomycin (100 µg/mL). Bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO2 über Nacht behalten.Hinweis: mindestens 1-2 x 107 SH-SY5Y Zellen f?…

Representative Results

Ca2 + Rückhaltevermögen Vertreter folgendes Ergebnis:Die Ergebnisse wurden als Fluoreszenz-Werte. Mit der zusätzlichen Impulsen von Ca2 + (200 Nmols/mg mitochondrialen Proteins), die Fluoreszenz durch doppelte über dem Ausgangswert mit der Eröffnung von mPTP erhöht. 5 μM Bongkrekate (BKA), ein Inhibitor von Ca2 +-induzierte mPTP Öffnung oder 1 μM Atractyloside (ATR), Aktivator von Ca2 +-induzierte mPTP Öffnung, wurden in d…

Discussion

Wir beschrieben hier, ein einfaches und effektives Protokoll für die mitochondriale Ca^{2 +} Retention Kapazität Assay und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst.

Stellen Sie für die mitochondriale Isolierung sicher, dass alle Materialien und Rohre auf Eis, besonders wenn die Zellen zu homogenisieren. 0,25 % Trypsin-EDTA kann auch verwendet werden, um Zellen aus der Schale für 5 min bei 37 ° c zu lösen Nach 15-25 Schlägen ist es notwendig, die intakte Zellme…

Materials

SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001