Visualización y en proyección de imagen del Oligodendrocyte organelos en rebanadas de cerebro Organotypic mediante Virus Adeno-asociado y Microscopía Confocal
Summary
Oligodendrocytes myelinating promoción la propagación del potencial de acción rápida y la supervivencia neuronal. Descrito aquí es un protocolo específico de oligodendrocyte expresión de proteínas fluorescentes en organotypic rebanadas de cerebro con imágenes de lapso de tiempo posterior. Además, se presenta un procedimiento sencillo para la visualización de mielina sin manchas.
Abstract
Las neuronas dependen del aislamiento eléctrico y soporte trófico de oligodendrocytes myelinating. A pesar de la importancia de los oligodendrocitos, las herramientas avanzadas actualmente utilizadas para estudiar las neuronas, sólo en parte se han tomado por los investigadores del oligodendrocyte. Celular tipo-específicas de tinción por transducción viral es un enfoque útil para estudiar dinámica organelo vivo. Este papel describe un protocolo para visualizar las mitocondrias oligodendrocyte en rebanadas de cerebro organotypic por transducción con virus adeno-asociado (AAV) portadores de genes para proteínas mitocondriales de fluorescentes específicos bajo el control transcripcional de el promotor de la proteína básica de mielina. Incluye el protocolo para hacer organotypic rodajas de cerebro de ratón coronal. Un procedimiento para Time-lapse de imágenes de las mitocondrias luego sigue. Estos métodos pueden ser transferidos a otros organelos y pueden ser particularmente útiles para el estudio de organelos en la vaina de mielina. Finalmente, describimos una técnica fácilmente disponible para la visualización de la mielina sin manchas en rebanadas de vida por microscopia Confocal de la reflexión (núcleo). No requiere ningún equipo adicional y puede ser útil para identificar la vaina de mielina durante proyección de imagen vivo.
Introduction
Sustancia blanca del cerebro se compone de axones de neuronas envueltas en mielina, membrana plasmática prolongada especializada formada por oligodendrocitos. Mielina es necesaria para la supervivencia a largo plazo de axones myelinated y propagación del potencial de acción rápido y confiable, y una pérdida de mielina puede causar disfunción neurológica. A pesar de su importancia, las propiedades de los oligodendrocitos son menos conocidos en comparación con las neuronas y astrocitos. En consecuencia, menos herramientas han sido desarrolladas para el estudio de oligodendrocitos.
Vivo la proyección de imagen de orgánulos celulares como mitocondrias, retículo endoplasmatic (ER) o diferentes estructuras vesiculares pueden ser útiles para el estudio de los cambios dinámicos en los organelos en el tiempo. Tradicionalmente, se ha realizado la proyección de imagen de los oligodendrocitos de la vida en monocultivos1,2. Sin embargo, oligodendrocitos en monocultivo no muestran mielina compacta y organotypic o rebanadas de cerebro agudo por lo tanto, pueden ser una mejor opción al estudiar la localización y movimiento de organelos. Localización de pequeños orgánulos y las proteínas en la mielina puede ser difícil debido a la corta distancia entre el axón mielinizado y la vaina de mielina alrededor. Así, luz microscópico immunostaining procedimientos solo no tiene la resolución espacial para discriminar entre orgánulos en la vaina de mielina y el axón mielinizado. Esto se puede solucionar por transducción viral con genes de proteínas fluorescentes dirigidos a organelo impulsados por promotores específicos del tipo de célula. Las ventajas son una expresión celular específicos y escasa, que permite la evaluación precisa de la localización de organelas y dinámica. Animales transgénicos pueden también utilizarse para lograr tal una expresión célula-específica orientada a organelas3. Sin embargo, la producción y mantenimiento de los animales transgénicos es caros y generalmente no ofrece la expresión escasa que puede lograrse mediante métodos virales.
El método descrito aquí utiliza transducción viral de oligodendrocitos con proteínas fluorescentes dirigidos a mitocondrial (dsred o verde fluorescente protein, GFP) impulsado por el promotor de la proteína básica de mielina (MBP-mito-dsred o MBP-mito-GFP) para visualizar mitocondrias de oligodendrocyte en rebanadas de cerebro organotypic. Además, la expresión de otra proteína fluorescente en el citoplasma (GFP con dsred mito o tdtomato con mito-GFP) se utiliza para permitir la visualización de la morfología de la célula, incluyendo los compartimientos citoplásmicos de la vaina de mielina. El protocolo incluye el procedimiento para hacer rebanadas de cerebro organotypic (una versión modificada del protocolo descrito por De Simoni y Yu, 20064,5). A continuación describimos el procedimiento Time-lapse de imágenes para estudiar movimiento mitocondrial. Este procedimiento utiliza un microscopio confocal vertical con un intercambio continuo de medio de imágenes, una configuración que permite la fácil aplicación de drogas u otros cambios medio durante proyección de imagen. El Time-lapse imagen puede realizarse en cualquier microscopio confocal, con algún equipo adicional para el mantenimiento de sectores de la vida como se describe a continuación. El protocolo también contiene varios consejos para optimizar la proyección de imagen y reducir fototoxicidad.
Por último, se describe una forma rápida y simple para visualizar la mielina sin manchas por Microscopía Confocal de la reflexión (núcleo). Esto puede ser útil para identificar la vaina de mielina durante proyección de imagen vivo. En los últimos años, varias técnicas se han desarrollado para mielina imagen sin ninguna tinción requiere, pero la mayoría de estos requieren específicos equipo y experiencia6,7,8. El procedimiento descrito aquí utiliza las propiedades reflectantes de la vaina de mielina y es una versión de longitud de onda de excitación única simplificada de la Microscopía Confocal espectral de la reflexión (la puntuación, en el que varias longitudes de onda del laser se combina para visualizar la mielina) 9. núcleo puede hacerse en cualquier microscopio confocal que tiene un 488 nm láser y un filtro de emisión de banda 470-500 nm o un filtro de emisión ajustables.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo para hacer las culturas organotypic descritas aquí es una versión modificada18 del protocolo descrito por De Simoni y Yu (2006)5. Los cambios más importantes han sido subrayados a continuación. Tampón Tris se añade al medio de cultivo, que mejora la supervivencia de las láminas cuando están fuera de la incubadora durante la transducción viral y cambio del medio celular. También se modifica el procedimiento de esterilización de confeti. Mientras que o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Linda Hildegard Bergersen y Magnar Bjørås para el acceso a laboratorio y equipos, personal de Janelia Biología Molecular compartido recursos para la producción de virus y plásmidos y Koen Vervaeke ayuda con medidas de potencia láser de la célula. Este trabajo fue financiado por la Asociación Noruega de salud, el Consejo Noruego de la investigación y el equipo de microscopía fue financiado por Norbrain.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
Riferimenti
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