TIP60 短暂耗竭后乳腺上皮细胞迁移的活体影像学研究
Summary
在这里, 我们提出了实时监测细胞迁移在伤口愈合试验中使用 TIP60-depleted MCF10A 乳腺上皮细胞。在我们的协议中实现了活细胞成像技术, 使我们能够实时和跨时间地分析和可视化单细胞运动。
Abstract
伤口愈合试验是有效的, 也是研究细胞迁移的最经济的方法之一体外。传统上, 图像是在实验开始和结束时使用相衬显微镜, 并通过闭合伤口来评估细胞的迁移能力。然而, 细胞运动是一种动态现象, 传统的方法不允许追踪单细胞运动。为了改善目前的伤口愈合检测方法, 我们使用活细胞成像技术实时监测细胞迁移。这种方法使我们能够确定细胞迁移率的基础上的细胞跟踪系统, 并提供了更明确的区分细胞迁移和细胞增殖。在这里, 我们演示了使用活细胞成像在伤口愈合的检测, 以研究不同的迁移能力的影响乳腺上皮细胞 TIP60 的存在。由于细胞运动是高度动态的, 我们的方法提供了更多的洞察力愈合的过程, 而不是一个伤口闭合拍摄的传统成像技术用于伤口愈合化验。
Introduction
HIV-达互动蛋白 60 kDa (TIP60) 是一种赖氨酸乙酰, 可以乙酰组蛋白和非组蛋白蛋白质1,2。它的功能被发现具有多重信号通路的含义, 包括转录, DNA 损伤修复, 和凋亡 1,3,4,5,67,8. 此外, TIP60 常 downregulated 于癌症, 其下调与癌症转移和生存率差有关9、10、11、12, 13,14。肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因。它是一个多步过程, 转移的初始步骤涉及肿瘤细胞向相邻组织的迁移和侵袭15,16。为了做到这一点, 肿瘤细胞首先必须脱离原发肿瘤肿块, 要么以集体侵入细胞表的形式, 要么作为分离的单个细胞17。在这个过程中, 肿瘤细胞经常发生上皮间转移 (急诊), 导致形态学和细胞黏附能力的变化17,18。
对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力进行了研究, 并对其进行了体外培养。其中, 伤口愈合试验是最有效和经济的19。首先, 这种方法涉及在细胞的汇合单层上创建人工间隙, 从而允许细胞迁移和闭合间隙。第二, 在实验开始和结束时可以捕捉到间隙的图像。最后, 通过比较间隙闭合来确定细胞迁移率。相衬显微镜通常用于捕捉图像的传统伤口愈合的化验。伤口愈合试验的另一个优点是它部分类似于体内肿瘤细胞的迁移。与体内肿瘤转移相似, 伤口愈合过程中的细胞迁移表现为上皮片的集体迁移和分离单细胞的迁移。
然而, 细胞迁移是已知的动态的, 并且有需要记录细胞的移动在实时。例如, 一个传统的伤口愈合试验不允许研究员分析单细胞运动。另一方面, 培养伤口愈合的细胞通常是缺乏血清的, 以抑制细胞增殖。这样做是为了排除因细胞增殖而导致间隙闭合的可能性。尽管如此, 还是会有一些增殖和细胞死亡, 并且在实验前后所拍摄的相衬图像无法区分它们。
活细胞成像技术解决了这一局限性的常规伤口愈合的化验。使用实时成像显微镜结合 CO2孵化器和适当的温度控制, 研究人员可以测量间隙大小及其在一段时间内的闭合速率, 同时跟踪位于侵入前线因此, 实施活细胞成像监测细胞迁移不仅将提供更好的可视化细胞迁移, 但也将允许区分细胞迁移和细胞增殖的可能性, 从而提供了一个更细胞迁移的可靠分析。
在这项研究中, MCF10A 乳腺上皮细胞被用来证明伤口愈合试验和活细胞成像的结合, 以研究 TIP60 在细胞迁移中的作用。TIP60 的耗竭导致 MCF10A 细胞迁移能力的提高。
Protocol
Representative Results
Discussion
众所周知, 在细胞迁移的过程中, 细胞可以以附着板的形式移动;松散簇;或单个独立的单元格。细胞侵袭的模式和动力可以从一个条件变化到另一个, 而表型在数小时内就会改变。传统的伤口愈合试验是基于从显微镜拍摄的长时间间隔, 如12或24小时的快照照片。这使得难以捕捉伤口闭合的动态和细胞运动的模式。
另一方面, 活细胞成像系统监测细胞迁移在一个更短的时间间隔 (30…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢贾实验室的成员的有益的讨论和评论。s.j 得到了新加坡国家研究基金会和新加坡教育部在其卓越研究中心倡议下向新加坡癌症科学研究所 (R-713-006-014-271) 提供的赠款, 国家医学研究理事会 ( CBRG – ;BNIG11nov001 和 CS-表意文字;R-713-000-162-511), 教育部学术研究基金 (教育部 AcRF 级 1 T1-2012 10月04日)。Y.Z.、分析和 C.Y.T. 都得到新加坡国立大学新加坡癌症科学研究所颁发的研究生奖学金的支持。
Materials
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
Riferimenti
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