Live-Darstellung der Brust Epithelzelle Migration nach der vorübergehenden Erschöpfung der TIP60
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen die Echtzeit-Überwachung der Zellwanderung in einem Wundheilung Assay mit TIP60-abgereicherte MCF10A Brust Epithelzellen. Die Umsetzung des live-Zelle bildgebender Verfahren in unserem Protokoll erlaubt uns, Analyse und Visualisierung von einzelligen Bewegung in Echtzeit und über die Zeit.
Abstract
Die Wundheilung Assay ist effizient und eine der günstigsten Möglichkeiten, um Zelle Migration in-vitro-Studie. Konventionell, Bilder sind am Anfang und Ende eines Experiments mit dem Phasenkontrast-Mikroskop genommen, und die Migration-Fähigkeiten der Zellen werden durch die Schließung der Wunden ausgewertet. Jedoch Zellbewegung ist ein dynamisches Phänomen und eine konventionelle Methode lässt sich nicht für die Verfolgung von einzelligen Bewegung. Um aktuelle Wundheilung Assays zu verbessern, verwenden wir Leben-Zelle bildgebende Verfahren Zellwanderung in Echtzeit zu überwachen. Diese Methode ermöglicht es uns, festzustellen, die Zelle Migrationsrate basierend auf eine Zelle, die tracking-System und bietet eine klarere Unterscheidung zwischen Zellwanderung und Zellproliferation. Hier zeigen wir den Einsatz von live Cell Imaging Wundheilung Assays, die unterschiedliche Migration Fähigkeiten der Brust Epithelzellen beeinflusst durch das Vorhandensein von TIP60 zu studieren. Wie Zelle Motilität sehr dynamisch ist, bietet unsere Methode weitere Einblicke in die Prozesse der Wundheilung als eine Momentaufnahme der Wundverschluss mit den traditionellen bildgebenden Verfahren zur Wundheilung Assays aufgenommen.
Introduction
HIV-Tat-interaktive Protein 60 kDa (TIP60) ist eine Lysin-Acetyltransferase, die Histone und nicht-Histonproteine1,2acetylate kann. Seine Funktionen befinden sich in mehrere Signalwege, einschließlich Transkription, DNA-Schäden reparieren und Apoptose1,3,4,5,6, Auswirkungen haben 7 , 8. Darüber hinaus TIP60 ist oft herunterreguliert bei Krebsarten, und die Herunterregulierung ist korreliert mit Krebsmetastasen und schlechten Überlebensraten9,10,11,12, 13,14. Tumor Metastasen ist die Hauptursache von Krebs-Todesfälle. Es ist ein mehrstufiger Prozess, und der erste Schritt der Metastasierung beinhaltet die Migration und Invasion von Tumorzellen in benachbarte Gewebe15,16. Um dies zu tun, Tumorzellen zuerst müssen aus der Masse der Primärtumor, entweder in Form von einem Kollektiv eindringenden Zelle Blatt lösen oder losgelöst als Einzelzellen17. Während dieses Prozesses werden Tumorzellen oft epithelialen, mesenchymale Transition (EMT), was zu Veränderungen in der Morphologie und Zelle Adhäsion Fähigkeit17,18unterzogen.
Ein paar Techniken wurden entwickelt, um die Migration zu studieren und Invasion Fähigkeit von Tumor-Zellen in Vitro. Unter ihnen ist die Wundheilung Assay die effiziente und kostengünstige19. Zunächst beinhaltet diese Methode die Schaffung einer künstlichen Lücke auf eine konfluierende Monolage von Zellen, wodurch die Zellen zu migrieren und die Lücke zu schließen. Zweitens können Bilder der Lücken am Anfang und Ende des Experiments erfasst werden. Schließlich wird ein Vergleich der Lückenschluss zur Bestimmung des Zellmigration. Phasenkontrast-Mikroskop wird in der Regel verwendet, um Bilder für konventionelle Wundheilung Assays zu erfassen. Ein weiterer Vorteil der Wundheilung Test ist, dass es teilweise in Vivo Tumor Zellwanderung ähnelt. Ebenso zeigt Zellwanderung in Wundheilung Assays zur in-Vivo Tumor Metastasen der kollektiven Migration der epithelialen Blätter und die Migration von freistehenden Einzelzellen.
Allerdings Zellwanderung ist bekannt, dass dynamische, und gibt es eine Notwendigkeit, die Bewegung der Zellen in Echtzeit zu dokumentieren. Zum Beispiel erlaubt ein konventionelle Wundheilung Assay kein Forscher, einzelne Zelle Bewegung zu analysieren. Auf der anderen Seite sind Zellen kultiviert für Wundheilung Assays oft Serum-verhungert, Zellproliferation hemmen. Dies soll der Lückenschluss durch Zellproliferation nicht ausschließen. Dennoch, es werden einige Proliferation und Zelltod und Phasenkontrast-Aufnahmen vor und nach das Experiment sind nicht in der Lage zu unterscheiden.
Das Leben-Zelle bildgebende Verfahren befasst sich mit dieser Einschränkung von konventionellen Wundheilung Assays. Mit einem live-Imaging Mikroskop kombiniert mit einer CO2 Inkubator und entsprechende Temperierung, können Forscher messen die Lückengröße und Steuersatzes Schließung im Laufe der Zeit während der Verfolgung der Bewegung aktiv Migration Zellen befindet sich an den Spitzen der invasive vorne. Daher die Umsetzung von live-Cell imaging zur Überwachung der Zellwanderung bieten nicht nur bessere Visualisierung der Zellwanderung, sondern ermöglicht es auch die Möglichkeit zur Unterscheidung Zellwanderung und Zellproliferation, wodurch eine mehr zuverlässige Analyse der Zellmigration.
In dieser Studie wurden MCF10A Brust Epithelzellen zur Kombination der Wundheilung Assay und live-Cell imaging zur Untersuchung der Rolle von TIP60 in Zelle Migration zu demonstrieren. Die Erschöpfung der TIP60 führt zu zunehmenden Migration Fähigkeiten in den MCF10A Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist bekannt, dass in den Prozess der Zellwanderung, Zellen entweder Bewegung in Form von anhaftenden Blättern können; losen Cluster; oder einzelnen, isolierten Zellen. Den Modus und die Dynamik der Zellinvasion variieren von einem Zustand zum anderen, und der Phänotyp kann innerhalb von Stunden ändern. Die traditionelle Wundheilung Assay basiert auf Snapshot Bilder aus dem Mikroskop mit einer lange Zeit-Intervall, z. B. 12 oder 24 Stunden. Dies erschwert es, die Dynamik der Wundverschluss und das Muster der Zelle …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken die Mitgliedern des Ji-Labors für ihre hilfreiche Diskussion und Kommentare. S.J wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Research Foundation Singapur und das Singapur Bildungsministerium unter seine Forschungszentren der Exzellenzinitiative zu dem Krebs Science Institute of Singapore (R-713-006-014-271), der nationalen medizinischen Forschungsrat (CBRG-NIG; BNIG11nov001 und CS-IRG; R-713-000-162-511), akademische Forschungsfonds Bildungsministerium (MOE AcRF Stufe 1 T1-2012 Okt-04). Y.Z, G.S.C. und C.Y.T. wurden durch ein Post-graduate Fellowship von Krebs Science Institute of Singapore, National University of Singapore ausgezeichnet unterstützt.
Materials
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
Riferimenti
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