Live-imaging della migrazione delle cellule epiteliali della mammella dopo lo svuotamento transitorio di TIP60
Summary
Qui, presentiamo il monitoraggio in tempo reale della migrazione cellulare in un’analisi di guarigione usando cellule epiteliali MCF10A TIP60-vuotati del seno. L’implementazione di tecniche di imaging di cellule vive nel nostro protocollo permette di analizzare e visualizzare la cella singola movimento in tempo reale e attraverso il tempo.
Abstract
Il dosaggio di cicatrizzazione è efficiente e uno dei modi più economici per lo studio di migrazione delle cellule in vitro. Convenzionalmente, immagini sono prese all’inizio e alla fine di un esperimento usando un microscopio a contrasto di fase, e le capacità di migrazione delle cellule vengono valutate tramite la chiusura delle ferite. Tuttavia, il movimento cellulare è un fenomeno dinamico, e un metodo convenzionale non consente per il tracciamento del movimento di cella singola. Per migliorare l’attuale saggi di guarigione delle ferite, utilizziamo tecniche di imaging di cellule vive per monitorare la migrazione cellulare in tempo reale. Questo metodo permette di determinare il tasso di migrazione delle cellule basato su una sistema di tracciamento di cella e fornisce una più chiara distinzione tra migrazione cellulare e la proliferazione delle cellule. Qui, noi dimostrare l’uso di formazione immagine di cellule vive in saggi di guarigione per studiare le abilità differenti migrazione delle cellule epiteliali della mammella, influenzate dalla presenza di TIP60. Motilità cellulare è altamente dinamica, il nostro metodo fornisce ulteriori approfondimenti i processi di guarigione rispetto ad un’istantanea della chiusura della ferita scattata con le tecniche di imaging tradizionale utilizzate per le analisi di cicatrizzazione della ferita.
Introduction
Proteina HIV-Tat-interattiva 60 kDa (TIP60) è un acetiltransferasi di lisina che possono acetilano sia degli istoni e proteine non istoniche1,2. Le sue funzioni si trovano ad per avere implicazioni in molteplici vie di segnalazione, compreso trascrizione, riparazione di danni al DNA e apoptosi1,3,4,5,6, 7 , 8. Inoltre, TIP60 è spesso downregulated nei cancri e suo downregulation è correlata con la metastasi del cancro e scarsa sopravvivenza prezzo9,10,11,12, 13,14. Metastasi del tumore è la causa principale della morte cancro-relativa. È un processo multi-step, e il passo iniziale della metastasi coinvolge la migrazione e l’invasione delle cellule del tumore nei tessuti adiacenti15,16. Al fine di farlo, le cellule del tumore in primo luogo necessario disconnettere dalla massa del tumore primario, sia nella forma di un foglio di cella collettivamente invasori o come staccato celluli17. Durante questo processo, le cellule tumorali subiscono spesso epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), con conseguente cambiamenti nella morfologia e cellula adesione capacità17,18.
Alcune tecniche sono state sviluppate per studiare la migrazione e la capacità di invasione del tumore le cellule in vitro. Tra di loro, il dosaggio di cicatrizzazione è più efficiente ed economico19. In primo luogo, questo metodo prevede la creazione di uno spazio artificiale su un monostrato confluente di cellule, così permettendo che le cellule di migrare e colmare il divario. In secondo luogo, le immagini delle lacune possono essere catturati all’inizio e alla fine dell’esperimento. Infine, un confronto di chiusura gap viene utilizzato per determinare il tasso di migrazione cellulare. Un microscopio a contrasto di fase è solitamente usato per catturare immagini per saggi convenzionali di cicatrizzazione. Un altro vantaggio del dosaggio cicatrizzazione è che assomiglia in parte in vivo migrazione delle cellule tumorali. Allo stesso modo in vivo metastasi tumorali, migrazione cellulare in saggi di guarigione viene illustrato sia la migrazione collettiva di fogli epiteliale e la migrazione di singole cellule indipendente.
Tuttavia, migrazione delle cellule è conosciuta per essere dinamico e c’è un bisogno di documentare il movimento delle cellule in tempo reale. Per esempio, un test convenzionali di guarigione non consente un ricercatore analizzare il movimento di cella singola. D’altra parte, cellule coltivate per i test di guarigione sono spesso siero-affamate di inibire la proliferazione delle cellule. Questo viene fatto per escludere la possibilità di chiusura gap a causa di proliferazione delle cellule. Comunque, ci sarà ancora qualche proliferazione e morte cellulare e contrasto di fase immagini scattate prima e dopo l’esperimento sono in grado di distinguere tra di loro.
La tecnica di imaging di vivere-cella risolve questa limitazione di saggi convenzionali di guarigione. Utilizzando un microscopio di vivere-imaging combinato con un incubatore a CO2 e controllo di temperatura adeguata, i ricercatori possono misurare le dimensioni di gap e il tasso di chiusura nel tempo mentre traccia il movimento di migrazione attivamente cellule situato alle punte della invasivo anteriore. Quindi, l’implementazione di imaging per monitorare la migrazione delle cellule cellule vive non solo fornirà la migliore visualizzazione della migrazione cellulare, ma permetterà anche la possibilità di distinguere tra migrazione cellulare e la proliferazione delle cellule, fornendo così una più analisi affidabile della migrazione cellulare.
In questo studio, le cellule epiteliali del seno di MCF10A sono state utilizzate per dimostrare la combinazione del dosaggio di guarigione e di imaging per studiare il ruolo di TIP60 nella migrazione cellulare cellule vive. Lo svuotamento di TIP60 si traduce in capacità di aumento della migrazione in cellule di MCF10A.
Protocol
Representative Results
Discussion
È noto che nel processo di migrazione delle cellule, le cellule possono spostare sotto forma di fogli aderenti; cluster sciolti; o singole, isolate cellule. La modalità e la dinamica di invasione delle cellule può variare da uno stato a altro, e il fenotipo può cambiare nel giro di ore. Il tradizionale saggio di guarigione è basato su snapshot foto scattate da un microscopio con un intervallo di tempo, ad esempio 12 o 24 ore. Questo rende difficile catturare la dinamica della chiusura della ferita e il modello di mo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio GAI per loro utili discussioni e commenti. S.J. è stato sostenuto da sovvenzioni da il Singapore National Research Foundation e il Ministero dell’istruzione di Singapore sotto i suoi centri di ricerca dell’iniziativa di eccellenza per il cancro Science Institute di Singapore (R-713-006-014-271), la National Medical Consiglio di ricerca (CBRG-NIG; BNIG11nov001 e CS-IRG; R-713-000-162-511), il fondo di ricerca accademica del Ministero della pubblica istruzione (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 ott -04). Y.Z., G.S.C e C.Y.T. sono stati sostenuti da una borsa di studio post-laurea assegnato dal cancro Science Institute di Singapore, National University of Singapore.
Materials
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
Riferimenti
- Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).
- Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53. J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).
- Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage. Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).
- Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. Cellular functions of TIP60. Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).
- Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT. Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).
- Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity. Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).
- Sykes, S. M., et al. Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction. Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).
- Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis. Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).
- Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival. J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).
- Gorrini, C., et al. Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response. Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).
- Jha, S., et al. Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway. Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).
- Kim, J. H., et al. Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes. Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).
- Sakuraba, K., et al. Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer. Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).
- Subbaiah, V. K., et al. E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60. Oncogene. , (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Zhang, Y., et al. TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program. J Mol Cell Biol. , (2016).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
