Müller Glia celle aktivering i en Laser-induceret Retinal Degeneration og Regeneration Model i zebrafisk
Summary
For zebrafisk er en populær animalsk model til at studere mekanismer af retinale degeneration eller regenerering i hvirveldyr. Denne protokol beskriver en metode til at fremkalde lokaliserede skade forstyrre den ydre retina med minimal skade på den indre nethinde. Efterfølgende, overvåger vi i vivo retinal morfologi og Müller glia svar i hele retinal regenerering.
Abstract
En fascinerende forskellen mellem teleost og pattedyr er livslang potentialet i teleost nethinden for retinal neurogenese og regeneration efter alvorlige skader. Undersøge regenerering veje i zebrafisk kan bringe nye indsigt til at udvikle innovative strategier til behandling af retinale degenerative sygdomme i pattedyr. Heri, fokuserede vi på induktion af en fokal læsion på ydre nethinden i voksen zebrafisk ved hjælp af en 532 nm diodelaser. En lokaliseret skade giver mulighed for at undersøge biologiske processer, der finder sted under retinal degeneration og regeneration direkte på området af skader. Bruger ikke-invasiv optisk kohærens tomografi (OCT), vi var i stand til at definere placeringen af det beskadigede område og overvåge efterfølgende regenerering in vivo. Faktisk, OCT imaging producerer høj opløsning, tværsnitsdata billeder af zebrafisk nethinden, at give oplysninger, som var tidligere kun tilgængelig med histologiske analyser. For at bekræfte data fra real-time OLT, histologiske sektioner blev udført og regenerativ svar efter induktion af den retinale skade blev undersøgt af Immunhistokemi.
Introduction
Vision er sandsynligvis den mest afgørende følelse af mennesket og dets værdiforringelse har en høj socioøkonomisk virkning. I den industrialiserede verden tegner retinal degenerative sygdomme sig for størstedelen af synstab og blindhed blandt den voksne befolkning1. Retinitis pigmentosa (RP) er den mest almindelige arvelige årsag til blindhed i mennesker i alderen mellem 20 og 60, der påvirker omkring 1,5 millioner mennesker på verdensplan2,3. Det er en heterogen familie af arvelig retinal lidelser karakteriseret ved gradvis tab af fotoreceptorer (PRs) efterfulgt af degeneration af retinale pigment epitel og efterfølgende, gliosis og ombygning af indre neuroner4. Løbet af sygdommen kan forklares ved den gradvise tab af de to PR celletyper, som regel starter med stænger, som er ansvarlige for akromatisk vision i svagt lys, og kegler, som er afgørende for farve vision og synsskarphed5. En enkelt gendefekt er tilstrækkeligt til at forårsage RP. Mere end 130 mutationer i over 45 gener har hidtil været forbundet med sygdom6. Dette fører til varierende sygdom fænotyper og er en af grundene til at genterapi er ikke noget generaliserbart og dermed en indviklet terapeutisk tilgang. Derfor er der et presserende behov for at udvikle nye generelle terapeutiske tilgange til behandling af retinale degenerations i blændende sygdomme.
Retinal degeneration ofte indebærer PR tab; Derfor er PR celledød kendetegnende for de degenerative processer i nethinden7. Det er allerede blevet påvist, at PR celledød stimulerer Müller glia cell (MC) aktivering og spredning8. MCs, den store glial celletype i hvirveldyr nethinden, var engang anset for at være intet mere end en “lim” mellem retinal neuroner. I de seneste år, har mange undersøgelser vist, at MCs fungere som mere end blot strukturel støtte9. Blandt de forskellige funktioner, MCs deltager også i neurogenese og reparere10. Faktisk svar på diffusible faktorer fra udarter nethinden øge MCs betydeligt glial fibrillære sure protein (GFAP) udtryk. GFAP mærkning kan derfor bruges som markør for MC aktivering som en sekundær reaktion på retinal skader og degeneration11.
For nylig har udviklet vi en roman tilpasning af fokale skade ved hjælp af en laser til at fremkalde retinal degeneration i zebrafisk (Danio rerio). Fokale skade er en fordel for at studere visse biologiske processer såsom migration af celler i det skadede sted og den præcise timing af begivenheder, der finder sted under retinal regenerering12. Desuden, zebrafisk er blevet vigtigt i visuelle forskning på grund af ligheder mellem dens visuelle system og andre hvirveldyr. Brutto morfologiske og histologiske funktioner af menneskelige og teleost retinae vise nogle forskelle. I overensstemmelse hermed, menneskelige og zebrafisk retinae indeholder de samme store celle klasser organiseret i det samme lag mønster, hvor oplyse-sensing fotoreceptorer besætte det yderste lag, mens de retinale projektion neuroner, ganglion celler, opholder sig i inderste neuronal lag, proksimalt for linsen. De retinale interneurons, amacrine, bipolar, og horisontale celler, lokalisere i mellem den fotoreceptor og ganglion celle lag13. Desuden er zebrafisk nethinden kegle-domineret og derfor tættere på den menneskelige nethinde end eksempelvis intensivt undersøgt gnavere nethinden. En fascinerende forskellen mellem teleost og pattedyr er den vedvarende neurogenese i fisk nethinden og retinal regenerering efter en skade. I zebrafisk, kan MCs dedifferentiate og mægle regenerering i sårede nethinden14,15. I kylling har MCs nogle kapacitet også genindtræde cellecyklus og dedifferentiate. Efter retinal skade i voksne fisk, MCs vedtage visse karakteristika af stamceller og stamceller, overflytte til det beskadigede retinale væv og producere nye neuroner16. Gen expression profilering af pattedyr MCs afslørede uventede ligheder til retinal progenitorceller, og beviser for iboende neurogen potentiale af MCs i kylling, gnaver og endda menneskelige nethinde vokser17. Ikke desto mindre, hvorfor den regenerative svar i fugle og pattedyr er lavere sammenlignet med den robuste svar i fisk er endnu ikke forstået. Derfor kan forstå de endogene reparation mekanismer i zebrafisk foreslå strategier for stimulerende retinal regenerering i pattedyr og mennesker. Ansætte den endogene reparation mekanisme af MCs som et terapeutisk redskab til behandling af patienter med retinal degeneration ville have en fremragende effekt for vores samfund.
Heri, giver vi de nødvendige skridt til at ansætte degeneration eller regenerering af modellen i oftalmologiske forskning. Vi fokuserer først på inducerende fokale skader i neurosensory nethinden, derefter på billeddannelse af begivenhederne udvikler sig skaden site, og endelig visualisering inddragelse af tilstødende MCs. Den generelle protokol er relativt nemme at udføre og åbner en bred vifte af muligheder for at vurdere en retina bagefter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retinal regenerering/degeneration i zebrafisk har været undersøgt af forskellige tilgange som cytotoxin-medieret celle død22, mekanisk skade23og termisk skade24. Vi ansat en 532 nm diodelaser skade zebrafisk nethinden. Dermed giver vores model flere fordele. For eksempel, skabt vi hurtigt et veldefineret område af skade lokaliseret i den ydre retina, specielt i laget PRs. Desuden, denne eksperimentelle set-up kan ændres til at producere større …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke Martin Zinkernagel, MD, ph.d.- og Miriam Reisenhofer, ph.d. for hendes videnskabelige input på oprettelse af model og Federica Bisignani for hendes fremragende teknisk bistand.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
Riferimenti
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
