Le poisson-zèbre est un populaire modèle animal pour étudier les mécanismes de dégénérescence rétinienne/régénération chez les vertébrés. Ce protocole décrit une méthode pour induire des lésions localisées perturbant la rétine externe avec un minimum de dommages à la rétine interne. Par la suite, nous surveillons in vivo la morphologie de la rétine et la réponse de glia Müller tout au long de la régénération rétinienne.
Une fascinante différence entre téléostéen et mammifères est le potentiel tout au long de la rétine chez les téléostéens pour neurogenèse rétinienne et la régénération après des dommages graves. Enquête sur les voies de la régénération chez le poisson zèbre pourrait apporter de nouvelles connaissances pour élaborer des stratégies innovantes pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine chez les mammifères. Dans les présentes, nous nous sommes concentrés sur l’induction d’une lésion focale à la rétine externe chez le poisson zèbre adulte au moyen d’un laser à diode 532 nm. Une lésion localisée permet l’étude des processus biologiques qui ont lieu au cours de la dégénérescence rétinienne et de régénération directement à la zone de dommages. En utilisant la tomographie à cohérence optique non invasif (OCT), nous avons pu définir l’emplacement de la régénération ultérieure de zone et moniteur endommagée in vivo. En effet, l’imagerie OCT produit des images haute résolution et transversales de la rétine de poisson-zèbre, fournissant des informations qui étaient auparavant uniquement disponibles avec les analyses histologiques. Afin de confirmer les données de l’OCT en temps réel, les coupes histologiques ont été réalisées et régénératrice après l’induction de la lésion rétinienne a été étudiée par immunohistochimie.
Vision est probablement le sens essentiel de l’être humain et son atteinte a une forte incidence socio-économique. Dans le monde industrialisé, maladies dégénératives de la rétine constituent la majorité de la perte de la vision et de cécité chez la population adulte1. Rétinite pigmentaire (RP) est la cause héréditaire la plus fréquente de cécité chez les personnes âgées de 20 à 60, affectant environ 1,5 millions de personnes dans le monde entier2,3. C’est une famille hétérogène de rétiniennes héréditaires caractérisées par une perte progressive des photorécepteurs (PRs) suivie d’une dégénérescence de l’épithélium pigmentaire rétinien et, par la suite, une gliose et remodelage des neurones interne4. L’évolution de la maladie peut s’expliquer par la perte progressive des deux types de cellules PR, généralement en commençant avec les tiges, qui sont responsables de la vision achromatique dans la pénombre et les cônes, qui sont essentielles pour la vision et l’acuité de la couleur5. Un défaut génétique unique suffit à provoquer des RP. Jusqu’à présent, plus de 130 mutations dans les gènes de plus de 45 ont été associées à la maladie6. Cela conduit à divers phénotypes de la maladie et est une des raisons que la thérapie génique est non généralisables et donc une approche thérapeutique complexe. Par conséquent, il y a un besoin urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques générales pour traiter la dégénérescence rétinienne en aveuglant les maladies.
Souvent la dégénérescence rétinienne implique la perte de PR ; par conséquent, la mort cellulaire PR est une caractéristique des processus dégénératifs dans la rétine7. Il a déjà été démontré que la mort des cellules PR stimule Müller glia cellulaire (MC) activation et la prolifération des8. MCs, le type de cellules gliales majeur dans la rétine des vertébrés, étaient autrefois considéré comme rien de plus qu’une « colle » entre les neurones de la rétine. Ces dernières années, de nombreuses études ont montré que MCs agissent comme plus que simple structurels soutiennent le9. Parmi les différentes fonctions, MCs participent également à la neurogenèse et réparer10. En effet, en réponse à des facteurs diffusibles par la dégénérescence rétine, MCs augmentent considérablement expression de protéine fibrillaire acide gliale (GFAP). Par conséquent, GFAP étiquetage peut servir comme marqueur pour l’activation du MC en réponse secondaire à des lésions rétiniennes et dégénérescence11.
Récemment, nous avons développé une nouvelle adaptation de lésion focale en utilisant un laser pour induire la dégénérescence rétinienne chez le poisson zèbre (Danio rerio). Lésion focale est avantageuse pour l’étude de certains processus biologiques tels que la migration des cellules dans le site lésé et le calendrier précis des événements qui se produisent pendant la régénération rétinienne12. En outre, le poisson-zèbre est devenu important dans la recherche visuelle en raison des similitudes entre son système visuel et celui des autres vertébrés. Les caractéristiques morphologiques et histologiques bruts de rétines humaines et téléostéens présentent des différences peu. En conséquence, les rétines humaines et poisson-zèbre contiennent les mêmes classes de cellule majeur organisés dans le même modèle en couches, où les photorécepteurs de détection de lumière occupent la couche la plus externe, tandis que les neurones de projection rétinienne, les cellules de ganglion, résident dans la plus profonde couche neuronale, proximale de la lentille. Les interneurones rétiniens, les amacrines, bipolaire et les cellules horizontales, localiser entre les photorécepteurs et ganglion cellule couches13. En outre, la rétine du poisson-zèbre est dominée par les cônes et donc plus proche de la rétine humaine que, par exemple, la rétine rongeur étudiée. Une fascinante différence entre téléostéen et mammifères est la neurogenèse persistante dans rétine de poisson et de la régénération rétinienne après avarie. Chez le poisson zèbre, MCs peuvent dédifférenciation et médiation de régénération dans la rétine blessé14,15. Dans le poulet, MCs ont certaines capacité aussi à réintégrer le cycle cellulaire et de dédifférenciation. Suite à une lésion rétinienne chez les poissons adultes, MCs adoptent certaines caractéristiques des cellules souches et progénitrices, migrent vers le tissu rétinien endommagé et produisent de nouveaux neurones16. Le profil d’expression génique des mammifères MCs révèle inattendus similitudes avec cellules souches rétiniennes, et preuve intrinsèque potentiel neurogène des MCs dans le poulet, les rongeurs et rétine même humaine croît17. Néanmoins, pourquoi la réponse régénératrice chez les oiseaux et les mammifères est plus faible comparativement à la réponse robuste chez les poissons n’est pas encore compris. Par conséquent, la compréhension des mécanismes de réparation endogène chez le poisson zèbre peut suggérer des stratégies pour stimuler la régénération rétinienne chez les mammifères et les êtres humains. Utilisant le mécanisme de réparation endogène des MCs comme un outil thérapeutique pour le traitement des patients atteints de dégénérescence rétinienne aurait un impact exceptionnel pour notre société.
Ici, nous fournissons les étapes nécessaires pour utiliser le modèle de dégénérescence/régénération dans la recherche ophtalmologique. Nous nous sommes concentrés d’abord sur induisant des dommages focal dans la rétine neurosensorielle, puis sur l’imagerie des événements de développement sur le site de la blessure et enfin visualisation implication des MCs adjacents. Le protocole général est relativement facile à réaliser et ouvre un large éventail de possibilités pour l’évaluation de la rétine par la suite.
Régénération/dégénérescence rétinienne chez le poisson-zèbre a étudié différentes approches telles que de mort cellulaire cytotoxine22, une lésion mécanique23et lésion thermique24. Nous avons utilisé un laser à diode 532 nm à endommager la rétine de poisson-zèbre. Ainsi, notre modèle offre plusieurs avantages. Par exemple, nous avons créé rapidement une zone bien définie de lésions localisées dans la rétine externe, plus pr?…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Martin Zinkernagel, MD, PhD et Miriam Reisenhofer, PhD pour son apport scientifique à mettre en place le modèle et Federica Bisignani pour son aide technique excellente.
Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |