Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish
Summary
Zebrafish è un popolare modello animale per lo studio dei meccanismi di degenerazione/rigenerazione della retina nei vertebrati. Questo protocollo descrive un metodo per indurre lesioni localizzate interrompendo la retina esterna con danno minimo per la retina interna. Successivamente, monitoriamo in vivo la morfologia retinica e la risposta di glia di Müller durante rigenerazione retinica.
Abstract
Un’affascinante differenza tra teleosteo e mammiferi è il potenziale permanente della retina Teleostei per neurogenesi retinica e la rigenerazione dopo gravi danni. Studiando le vie di rigenerazione in zebrafish potrebbe portare a nuove comprensioni di sviluppare strategie innovative per il trattamento di malattie degenerative retiniche nei mammiferi. Qui, ci siamo concentrati sull’induzione di una lesione focale a retina esterna in zebrafish adulto per mezzo di un laser a diodo 532 nm. Una lesione localizzata permette di indagare i processi biologici che avvengono durante la degenerazione retinica e rigenerazione direttamente presso l’area di danno. Usando la tomografia a coerenza ottica non invasiva (OCT), siamo stati in grado di definire la posizione della rigenerazione successiva area e monitor danneggiata in vivo. Infatti, la formazione immagine OCT produce immagini ad alta risoluzione, a sezione trasversale della retina zebrafish, fornendo informazioni che era precedentemente disponibile solo con le analisi istologiche. Al fine di confermare i dati da ott in tempo reale, sono state eseguite sezioni istologiche e risposta rigenerativa dopo l’induzione della lesione retinica è stata studiata da immunohistochemistry.
Introduction
Visione è probabilmente il senso più essenziale dell’essere umano e la sua svalutazione ha un alto impatto socio-economico. Nei paesi industrializzati, le malattie degenerative retiniche rappresentano la maggior parte della perdita della vista e cecità fra la popolazione adulta1. Retinite pigmentosa (RP) è la causa ereditaria più comune di cecità nella gente fra le età di 20 e 60, che colpisce circa 1,5 milioni di persone in tutto il mondo2,3. È una famiglia eterogenea di malattie retiniche ereditarie caratterizzata da perdita progressiva dei fotorecettori (PRs) seguita da degenerazione dell’epitelio retinico del pigmento e, successivamente, il gliosis e il rimodellamento di neuroni interno4. Il corso della malattia può essere spiegato dalla perdita incrementale dei due tipi cellulari PR, solitamente a partire con i coni retinici, che sono responsabili della visione acromatico nella luce fioca e coni, che sono essenziali per la visione e l’acuità visiva del colore5. Un singolo difetto di gene è sufficiente per causare la RP. Finora più di 130 mutazioni in oltre 45 geni sono state associate con la malattia6. Questo conduce a diversi fenotipi di malattia ed è una ragione per cui la terapia genica è non generalizzabile e così un approccio terapeutico intricato. Di conseguenza, c’è un urgente bisogno di sviluppare nuove strategie terapeutiche generali per il trattamento di degenerazioni retiniche in accecante malattie.
Degenerazione retinica spesso comporta perdita di PR; Pertanto, la morte delle cellule di PR è un marchio di garanzia di processi degenerativi della retina7. Già è stato dimostrato che la morte delle cellule PR stimola Müller glia cella (MC) attivazione e proliferazione8. MCs, il tipo di cellule gliali principali nella retina dei vertebrati, una volta sono stati considerati per essere nient’altro che una “colla” tra neuroni retinici. Negli ultimi anni, molti studi hanno dimostrato che MCs agire come più di mera strutturali sostengono il9. Tra le diverse funzioni, MCs partecipare anche nella neurogenesi e10di riparazione. Infatti, in risposta a fattori diffusibili dalla degenerazione retina, MCs significativamente aumentare l’espressione di proteina silicea fibrillare glial (GFAP). Di conseguenza, GFAP etichettatura può essere utilizzato come un indicatore per l’attivazione di MC come una risposta secondaria a lesioni retiniche e degenerazione11.
Recentemente, abbiamo sviluppato un adattamento del romanzo di lesioni focali usando un laser per indurre la degenerazione retinica in zebrafish (Danio rerio). Lesione focale è vantaggioso per lo studio di alcuni processi biologici come la migrazione delle cellule nel sito di feriti e la tempistica precisa degli eventi che si svolgono durante la rigenerazione della retina12. Inoltre, il pesce zebra è diventato importante nella ricerca visiva a causa delle somiglianze tra il sistema visivo e quello di altri vertebrati. Lorda caratteristiche morfologiche ed istologiche di retine umane e Teleostei visualizzano alcune differenze. Di conseguenza, retine umane e zebrafish contengono le stesse classi principali delle cellule organizzate nello stesso modello a strati, dove la luce-sensing fotorecettori occupano lo strato più esterno, mentre i neuroni di proiezione retinica, le cellule del ganglio, risiedono nella parte più interna un neurone strato, prossimale alla lente. Gli interneuroni retinici, amacrine, bipolare e cellule orizzontali, localizzano tra strati di cellule del fotoricettore e del ganglio13. Inoltre, la retina di zebrafish è dominata dal cono e quindi più vicino alla retina umana che, ad esempio, la retina del roditore intensamente studiata. Un’affascinante differenza tra teleosteo e mammiferi è la persistente neurogenesi nella retina di pesce e rigenerazione della retina dopo danni. In zebrafish, MCs può dedifferentiate e mediare la rigenerazione in retina feriti14,15. Nel pollo, MCs hanno alcune capacità anche di inserire nuovamente il ciclo cellulare e di dedifferentiate. A seguito di lesione retinica in pesci adulti, MCs adottare determinate caratteristiche di cellule staminali e progenitrici, la migrazione verso il tessuto retinico danneggiato e produrre nuovi neuroni16. Profili di espressione genica di mammiferi MCs ha rivelato somiglianze inaspettate ai progenitori della retina, e prova per potenziale neurogenico intrinseco di MCs nella pollo, roditore e nella retina umana sta sviluppandosi17. Tuttavia, perché la risposta rigenerativa negli uccelli e nei mammiferi è inferiore rispetto con la risposta robusta nel pesce non è ancora capito. Di conseguenza, la comprensione dei meccanismi di riparazione endogena in zebrafish può suggerire strategie per stimolare la rigenerazione della retina in mammiferi ed esseri umani. Impiegando il meccanismo di riparazione endogena di MCs come strumento terapeutico per il trattamento dei pazienti con degenerazione retinica avrebbe un impatto eccezionale per la nostra società.
Qui, forniamo i passaggi necessari per utilizzare il modello di degenerazione/rigenerazione nella ricerca oftalmica. Prima ci siamo concentrati sulla induzione del danno focale nella retina neurosensoriale, quindi sulla formazione immagine degli eventi in via di sviluppo presso il sito di lesione e infine visualizzante coinvolgimento di MCs adiacente. Il protocollo generale è relativamente facile da effettuare e si apre una vasta gamma di possibilità per la valutazione della retina in seguito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rigenerazione/degenerazione retinica in zebrafish è stata studiata da diversi approcci quali citotossina-mediata delle cellule morte22, danno meccanico23e lesione termica24. Abbiamo impiegato un laser a diodo 532 nm per danneggiare la retina di zebrafish. In tal modo, il nostro modello offre diversi vantaggi. Per esempio, abbiamo creato rapidamente un’area ben definita di lesioni localizzate in retina esterna, in particolare nello strato PRs. Inoltr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Martin Zinkernagel, MD, PhD e Miriam Reisenhofer, PhD per il suo contributo scientifico a stabilire il modello e Federica Bisignani per la sua eccellente assistenza tecnica.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
Riferimenti
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