Müller Glia cellaktivering i en Laser-inducerad Retinal Degeneration och Regeneration modell i zebrafiskar
Summary
Zebrafiskar är en populär djurmodell att studera mekanismer av retinal degeneration/regeneration hos ryggradsdjur. Det här protokollet beskriver en metod för att framkalla lokaliserad skada störa yttre näthinnan med minimal skada på inre näthinnan. Därefter, övervakar vi i vivo näthinnans morfologi och Müller glia svaret i hela retinal regenerering.
Abstract
En fascinerande skillnad mellan Benfisk och däggdjur är livslångt potentialen för lever näthinnan för retinal neurogenes och förnyelse efter allvarliga skador. Undersöka de regenerering vägarna i zebrafiskar kan föra nya insikter att utveckla innovativa strategier för behandling av retinala degenerativa sjukdomar hos däggdjur. Häri, fokuserade vi på induktion av en fokal lesion på yttre näthinnan i vuxen zebrafisk genom en 532 nm diode laser. En lokaliserad skada kan undersöka biologiska processer som äger rum under retinal degeneration och regeneration direkt på området av skador. Använda icke-invasiv optisk koherenstomografi (OCT), vi skulle kunna definiera platsen för den skadade området och övervaka efterföljande regenereringen invivo. Faktiskt, OCT imaging producerar högupplösta, tvärsnittsdata bilder av zebrafisk näthinnan, som tillhandahåller information som var tidigare bara tillgänglig med histologiska analyser. För att bekräfta data från realtid OCT, histologiska sektioner utfördes och regenerativ svar efter induktion av retinal skadan undersöktes av immunohistokemi.
Introduction
Vision är förmodligen den mest grundläggande känslan av människan och dess nedskrivning har en hög socioekonomiska inverkan. I den industrialiserade världen står retinala degenerativa sjukdomar för majoriteten av synnedsättning och blindhet bland den vuxna befolkning1. Retinitis pigmentosa (RP) är den vanligaste ärftliga orsaken till blindhet hos personer i åldrarna 20 till 60, som drabbar cirka 1,5 miljoner människor världen över2,3. Det är en heterogen familj av ärftlig näthinnesjukdom kännetecknas av progressiv förlust av fotoreceptorer (PRs) följt av degeneration av pigmentepitelet och därefter gliosis och ombyggnad av inre nervceller4. Loppet av sjukdomen kan förklaras av inkrementella förlusten av de två PR-celltyper, vanligtvis börjar med stavar, som ansvarar för akromatisk vision i svagt ljus och kottar, som är väsentliga för färg vision och synskärpa5. En enda gendefekt är tillräcklig för att orsaka RP. Hittills har mer än 130 mutationer i gener som över 45 förknippats med sjukdom6. Detta leder till varierande sjukdom fenotyper och är en anledning till att genterapi är icke-generaliserbara och thus en intrikat terapeutisk metod. Därför finns det ett brådskande behov att utveckla nya allmänna terapeutiska tillvägagångssätt för att behandla retinal degeneration i bländande sjukdomar.
Retinal degeneration ofta innebär PR förlust; Därför är PR celldöd ett kännetecken för de degenerativa processerna i näthinnan7. Det har redan visat att PR celldöd stimulerar Müller glia cell (MC) aktivering och spridning8. MCs, den stora gliaceller Celltypen i ryggradsdjur näthinnan, en gång ansågs vara inget annat än ett ”klister” mellan näthinnans nervceller. Under de senaste åren har många studier visat att MCs agera som mer än enbart strukturella stöd9. Bland de olika funktionerna, MCs delta också i neurogenes och reparera10. Verkligen, som svar på diffusible faktorer från degenererande näthinnan, MCs avsevärt öka glial fibrillary sura (Fredsgenomförande) proteinuttryck. Fredsgenomförande märkning kan därför användas som en markör för MC aktivering som en sekundär reaktion på skada och degeneration11.
Nyligen har utvecklat vi en ny anpassning av fokal skada med hjälp av en laser för att inducera retinal degeneration i zebrafisk (Danio rerio). Fokal skada är fördelaktigt för att studera vissa biologiska processer såsom migration av cellerna i den skada platsen och exakta tidpunkten för händelser som äger rum under retinal regenerering12. Dessutom blivit zebrafiskar viktigt i visuella forskning på grund av likheterna mellan dess visuella systemet och andra ryggradsdjur. Brutto morfologiska och histologisk funktioner i mänskliga och lever retinae visar några skillnader. Följaktligen, mänskliga och zebrafiskar retinae innehåller samma stora cell klasserna organiserade i samma lager mönster, där ljus-sensing fotoreceptorer ockupera det yttersta lagret, medan retinal projektion nervceller, ganglioncellerna, bor i innerst neuronala lager, proximalt linsen. De retinala interneuroner, amakrina, bipolär, och horisontella celler, lokalisera mellan ljusmätare och ganglion cell lager13. Dessutom är Sebrafisken näthinnan kon-dominerade och därför närmare mänskliga näthinnan än, exempelvis intensivt studerat gnagare näthinnan. En fascinerande skillnad mellan Benfisk och däggdjur är den ihållande neurogenes i fisk näthinnan och retinal regeneration efter skador. I zebrafiskar, kan MCs dedifferentiate och förmedlar förnyelse i skadade näthinnan14,15. I kyckling har MCs viss kapacitet också att återinträda på cellcykeln och dedifferentiate. Efter skada i vuxen fisk, MCs anta vissa egenskaper hos stamceller och stamceller, migrera till den skadade retinala vävnaden och producerar nya nervceller16. Gen uttryck profilering av däggdjur MCs avslöjat oväntade likheter med retinal stamfäder och belägg för neurogen inneboende potential för MCs i kyckling, gnagare och även mänskliga näthinnan växer17. Ändå, varför regenerativ svaret i fåglar och däggdjur är lägre jämfört med den robust svaren på fisk är ännu inte förstått. Därför kan förstå den endogena reparationsmekanismer i zebrafiskar föreslå strategier för stimulerande retinal förnyelse i däggdjur och människor. Anställa den endogena reparation mekanismen för MCs som ett terapeutiskt verktyg för behandling av patienter med retinal degeneration skulle påverka utestående för vårt samhälle.
Häri, ger vi stegen för att anställa degeneration/regenerering av modellen i oftalmologiska forskning. Först fokuserade vi på inducerande fokala skador i sensorineural näthinnan, sedan på bildtagning av händelser utvecklar vid skadan webbplats och slutligen visualisera medverkan av intilliggande MCs. Det allmänna protokollet är relativt enkelt att utföra och öppnar ett brett utbud av möjligheter för att bedöma näthinnan efteråt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förnyelse/näthinneförtvining i zebrafisk har undersökts genom olika metoder såsom cellgift-medierad cell död22, mekanisk skada23och termisk skada24. Vi anställt en 532 nm diode laser skada zebrafiskar näthinnan. Därmed, erbjuder vår modell flera fördelar. Exempelvis skapade vi snabbt ett väldefinierat område skada lokaliserade i yttre näthinnan, särskilt i PRs lagret. Dessutom kan denna experimentella set-up modifieras för att produce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tacka Martin Zinkernagel, MD, PhD och Miriam Reisenhofer, PhD för hennes vetenskapliga insats på om upprättandet av modell och Federica Bisignani för hennes utmärkta tekniskt bistånd.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
Riferimenti
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
