Utarbeidelse av Chitosan-baserte injiserbare Hydrogels og dens anvendelse i 3D cellekultur
Summary
Her beskriver vi en lettvinte forberedelse av chitosan-baserte injiserbare hydrogels ved hjelp av dynamisk imine kjemi. Metoder for å justere den hydrogel mekanisk styrke og dens anvendelse i 3D cellekultur presenteres.
Abstract
Protokollen presenterer en lettvinte, effektiv og allsidig metode for å forberede chitosan-basert hydrogels med dynamisk imine kjemi. Hydrogel forberedt ved å blande glykol chitosan løsninger med en syntetisk benzaldehyde avsluttet polymer gelator, og hydrogels er effektivt oppnådd i flere minutter ved romtemperatur. Av varierende forhold mellom glykol chitosan, polymer gelator og vann innholdet hentes allsidig hydrogels med forskjellige gelation ganger og stivhet. Når skadet, kan hydrogel gjenopprette sine opptredener og modulus, på grunn av Reversibilitet av dynamisk imine obligasjoner som crosslinkages. Selv healable egenskapen kan hydrogel skal injiserbare siden det kan være selvstendig helbredet fra presset stykker til en integrert bulk hydrogel etter injeksjon prosessen. Hydrogel er også flere forståelsesfull å mange bio-aktive stimuli på grunn av ulike balanse statuser av dynamisk imine obligasjoner. Denne hydrogel bekreftet som bio-kompatibel, og L929 musen fibroblast celler var innebygd følgende standard prosedyrer og celle spredning ble lett vurdert av en 3D-cellen dyrking prosess. Hydrogel kan tilby en justerbar plattform for forskjellige forskning der en fysiologisk etterligne av et 3D-miljø for cellene er profittert. Sammen med flere forståelsesfull, selv healable og injiserbare egenskaper, kan hydrogels potensielt brukes som flere operatører for narkotika og celler i fremtidige bio-medisinske anvendelser.
Introduction
Hydrogels er krysskoblet polymer materiale med store mengder vann og myk mekaniske egenskaper, og de har vært brukt i mange bio-medisinske programmer1,2. Hydrogels kan tilby en myk og våt miljø, som er svært lik fysiologiske omgivelsene for celler i vivo. Derfor har hydrogels blitt en av de mest populære stillasene for 3D celle kultur3,4. Sammenlignet med 2D Petriskål cellekultur, har 3D cellekultur avansert raskt for å tilby en ekstracellulær matrix (EFM) etterlignet microenvironment for cellene å kontakte og montere spredning og differensiering formål5. I tillegg kunne hydrogels som inneholder naturlige polymerer tilby bio-kompatibel og fremme miljøer for cellene til spredning og differensiere3. Hydrogels avledet fra syntetiske polymerer foretrekkes for sin enkle og klare komponenter, noe som utelukker komplekse påvirkninger som dyr opprinnelse proteiner eller virus. Blant alle hydrogel kandidater for 3D cellekultur er hydrogels som er lett forberedt og har en konsekvent eiendom alltid foretrukket. Anlegget å justere den hydrogel egenskaper tilpasses ulike forskning kravene er viktig som godt6.
Her introduserer vi en lettvinte forberedelse av en glykol chitosan-baserte hydrogel bruker dynamiske imine kjemi, som blir en allsidig hydrogel plattform for 3D celle kultur7. I denne metoden brukes kjente bio-kompatible glykol chitosan å etablere rammene av hydrogel’s nettverk. Dens amino grupper er reagerte med en benzaldehyde avsluttet polyetylenglykol som polymer gelator til dynamisk imine obligasjoner som crosslinkages av hydrogels8. Dynamisk imine obligasjoner kan danne og råtne reversibel og fleksibelt omgivelser, endowing hydrogels med mekanisk justerbar krysskoblet nettverk9,10,11. På grunn av sin høye vann innholdet, bio-kompatible materialer og justerbar mekaniske styrken, er hydrogel brukt som et stillas for L929 celler i 3D celle kultur12,13. Protokollen her detaljer prosedyrer, inkludert polymer gelator syntese, hydrogel forberedelse, celle innebygging og 3D celle dyrking.
Hydrogel viser også flere andre funksjoner på grunn av sin dynamiske imine crosslinkages, inkludert dens flere mottagelig for ulike bio-stimuli (syre/pH, vitamin B6 avledede pyridoxal, protein papain, etc.), som indikerer at hydrogel kunne indusert oppløse under fysiologiske forhold8. Hydrogel er også selv healable og injiserbare, som betyr hydrogel kunne administreres via en minimal invasiv injeksjon metode og få en fordel i narkotika og celle leveranser14,15. Legge til funksjonelle tilsetningsstoffer eller bestemte forhåndsutformede polymer gelators, hydrogel er forenlig å få bestemte egenskaper som magnetiske, temperatur, pH forståelsesfull, etc.16,17, som kan oppfylle en stort utvalg av forskning krav. Disse egenskapene avsløre den hydrogel potensiell kapasitet til å være en injectable flere operatører for narkotika og celler i både i vitro og i vivo bio-medisinsk forskning og programmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hydrogel presentert i denne protokollen (figur 1) har to hovedkomponenter: naturlige polymer glykol chitosan og en syntetisk benzaldehyde avsluttet polymer gelator DF pinne, som er både biokompatible materialer. Syntese av DF PEG er presentert ved hjelp av en ettrinns endring reaksjon. PEG av molekylvekt 4000 ble valgt i denne protokollen i bekymringene til løselighet, modifikasjon effektivitet, samt hydrogel stivhet. En rekke hydrogels med forskjellige mekanisk styrke var forberedt med fo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation of China (21474057 og 21604076).
Materials
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
Riferimenti
- Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
