Подготовка на основе хитозана инъекционные гидрогелей и его применение в культуре клеток 3D
Summary
Здесь мы описываем снисходительный подготовка на основе хитозана инъекционные гидрогели, с использованием динамических Имин химии. Представлены методы для регулировки гидрогеля механическую прочность и его применение в 3D клеточной культуры.
Abstract
Протокол представляет легким, эффективным и универсальным методом подготовить на основе хитозана гидрогели, с использованием динамических Имин химии. Гидрогель готовят путем смешивания растворов гликоля хитозана с gelator полимер синтезированных бензальдегида прекращено, и гидрогели эффективно получены в течение нескольких минут при комнатной температуре. На различные соотношения между гликоль хитозана, полимерные gelator и содержание воды получаются универсальный гидрогели с различными гелеобразования времена и скованность. Когда они повреждены, гидрогеля можно восстановить свои выступления и модуль упругости, благодаря обратимости динамических Имин облигаций как crosslinkages. Это самостоятельно обратимо свойство позволяет гидрогеля быть инъекционные, так как это может быть самостоятельной исцелил от сжал частей к неотъемлемой массовых гидрогеля после процесса впрыска. Гидрогель также мульти реагировать многих био активные стимулы за счет сбалансированности различных статусов динамических Имин облигаций. Этот Гидрогель был подтвержден как био совместимого и L929 клетки фиброцита мыши были встроенные следующие стандартные процедуры и пролиферации клеток легко оценивалась путем процесса выращивания 3D ячейки. Гидрогель может предложить регулируемые платформы для различных исследований, где прибыль физиологических мнемосхемы 3D среды для клеток. Наряду с его свойства мульти реагировать, самостоятельно обратимо и инъекционные гидрогели потенциально может быть применен как несколько перевозчиков наркотиков и клетки в будущем био медицинских приложений.
Introduction
Гидрогели, сшитых полимерных материалов с большим количеством воды и мягких механических свойств, и они были использованы в многих био медицинских приложений1,2. Гидрогели может предложить мягкой и влажной среде, которая очень похожа на физиологические окружение для клеток в естественных условиях. Таким образом гидрогели стали одним из самых популярных подмости для 3D клетки культуры3,4. По сравнению с 2D Петри клеточной культуры, 3D клеточной культуры выдвинул быстро предложить что внеклеточного матрикса (ECM) передразнил микроокружения клеток связаться и собрать для пролиферации и дифференцировки цели5. Кроме того гидрогели, содержащие полимеры природные может предложить био совместимых и содействие сред для клетки размножаются и дифференцировать3. Гидрогели на основе синтетических полимеров являются предпочтительными для их простые и ясные компонентов, исключающих комплекса воздействий как белки животного происхождения или вирусов. Среди всех кандидатов Гидрогель для 3D клеточной культуры гидрогели, которые легко приготовить и имеют последовательную свойства всегда являются предпочтительными. Возможность настроить свойства гидрогеля с учетом требований различных исследований имеет важное значение как хорошо6.
Здесь мы представляем снисходительный подготовка гликоль основе хитозана гидрогеля с использованием динамических Имин химии, которая становится универсальным гидрогеля платформой для 3D клетки культуры7. В этом методе известные био совместимого гликоль хитозана, используются для установления кадры гидрогеля сетей. Амино группы являются прореагировало с полиэтиленгликоля бензальдегида прекращено как полимер gelator сформировать динамический Имин облигации как crosslinkages гидрогелей8. Динамических Имин облигации может сформировать и разложить обратимо и ответственно к окружению, наделяя гидрогели с механически регулируемая высокоструктурированные сетей9,10,11. Благодаря своей высокой воды содержание, био совместимых материалов и регулируемые механических сильные гидрогеля успешно применяется в качестве лески для L929 клеток в 3D клетки культуры12,13. Протокол здесь детали процедуры, включая синтеза полимеров gelator, гидрогеля подготовку, клеток внедрение и культивирование 3D клеток.
Гидрогель также показывает ряд других особенностей, из-за его динамичный Имин crosslinkages, включая его мульти реагировать на различные био стимулы (кислоты/рН, витамин B6 производные пиридоксаль, папаин белков и т.д.), указав, что гидрогелевые может быть Индуцированная разложить в физиологических условиях8. Гидрогель также самостоятельно обратимо и инъекционные, что означает гидрогеля может быть управляются через минимально инвазивные инъекционный метод и получить преимущество в14,поставки наркотиков и ячейки15. Путем добавления функциональных добавок или конкретных предустановленных полимера gelators, гидрогеля совместим для получения определенных свойств как магнитные, температуры, рН реагировать, и т.д.16,17, который может выполнить широкий спектр исследовательских потребностей. Эти свойства показывают гидрогеля потенциал быть инъекционные несколько перевозчиков наркотиков и клетки как био медицинские исследования в пробирке и в естественных условиях , так и приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гидрогель, представленные в настоящем Протоколе (рис. 1) имеет два основных компонента: Хитозан гликоль природный полимер и синтетических бензальдегида прекращено полимера gelator DF PEG, которые оба биосовместимых материалов. Синтез DF PEG представлены с использованием реакци…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано национальной науки фонд Китая (21474057 и 21604076).
Materials
| Glycol chitosan | Wako Pure Chemical Industries | 39280-86-9 | 90% degree of deacetylation |
| 4-Carboxybenzaldehyde | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 619-66-9 | 99% |
| N, N'-dicyclohexylcarbodiimide | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 538-75-0 | 99% |
| Calcium chloride anhydrous | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 10043-52-4 | 96% |
| 4-dimethylamiopryidine | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD | 1122-58 | 99% |
| Polyethyleneglycol | Sino-pharm Chemical Reagent | 5254-43-7 | 99% |
| Tetrahydrofuran | Sino-pharm Chemical Reagent | 109-99-9 | 99% |
| Toluene | Sino-pharm Chemical Reagent | 108-88-3 | 99% |
| Ethyl ether | Sino-pharm Chemical Reagent | 60-29-7 | 99% |
| Acetic acid | Sino-pharm Chemical Reagent | 64-19-7 | 99% |
| Anhydrous CaCl2 | Sino-pharm Chemical Reagent | 10043-52-4 | 99% |
| Fluorescein diacetate | Sigma | 596-09-8 | 99% |
| Propidium iodide | Sigma | 25535-16-4 | 94% |
| RPMI-1640 culture media | Gibco | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 0.25% | |
| PBS | Solarbio | 0.01 M | |
| Penicillin streptomycin solution | Hyclone | 10,000 U/mL | |
| Rheometer | TA Instrument | AR-G2 | |
| Confocal microscope | Zeiss | 710-3channel | |
| L929 Cells | ATCC | NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L | |
| Evaporator | EYELA | N-1100 | |
| 48 guage needle | ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD | 48-guage | |
| Microscope | Leica | DM3000 B | |
| Microscope software | Imaris | ||
| Heat gun | Confu | KF-5843 | |
| Petri dish | NEST |
Riferimenti
- Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).
- Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
- Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
- Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
- Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
- Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
- Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
- Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
- Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
- Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
- Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
- Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
- Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
