Utarbeidelse av Keratin hydrolyse fra kylling fjær og dens anvendelse i kosmetikk

Summary

Målet med protokollen er å forberede keratin hydrolyse av kylling fjær av alkaliske-enzymatisk hydrolyse og å teste om legge keratin hydrolyse i en kosmetikk salve base forbedrer huden barriere funksjonen (høyne hydrering og reduseres transepidermal vanntap). Tester er utført på menn og kvinner frivillige.

Abstract

Keratin hydrolyserte (KHs) er etablert standard komponenter i hår kosmetikk. Forstå den fuktighetsgivende effekten av KH er fordelaktig for hudpleie kosmetikk. Målene for protokollen er: (1) å behandle kylling fjær i KH ved alkaliske-enzymatisk hydrolyse og rense det av dialyse, og (2) for å teste om tilføyer KH i en salve base (SR) øker fuktighet i huden og forbedrer huden barriere funksjon av avtagende transepidermal vanntap (TEWL). Under alkaliske-enzymatisk hydrolyse er fjær først ruges ved høyere temperatur i et alkalisk miljø og milde tilfeller hydrolyzed med proteolytisk enzym. Løsning av KH er dialyzed, vakuum tørket og malt til et fint pulver. Kosmetisk formuleringer bestående av olje i vann emulsjon (O/W) med 2, er 4 og 6 vekt % av KH (basert på vekten av OB) forberedt. Testing fuktighetsgivende egenskaper for KH utføres på 10 menn og 10 kvinner i tidsintervaller av 1, 2, 3, 4, 24 og 48 h. testet formuleringer er spredt på degreased volar underarmen nettsteder. Huden hydrering av stratum corneum (SC) vurderes ved å måle kapasitans av huden, som er en av de mest verdensomspennende brukt og enkle metodene. TEWL er basert på å måle mengden av vann transportert per en definert område og tid fra huden. Begge metodene er fullstendig ikke-invasiv. KH gir en utmerket occlusive; avhengig av tillegg av KH i OB bringer det om en 30% reduksjon i TEWL etter påføring. KH også fungerer som en humectant, som det binder seg vann fra de lavere lag av overhuden til SC; optimal KH tillegg i OB oppstår opp til 19% økning i hydration i menn og 22% økning i kvinner.

Introduction

Slakterier, næringsmiddelindustrien og soling industrien produserer årlig enorme mengder solid keratin biprodukter-ull, fjær, bust, hovene, klør, horn og lignende. Ifølge nyeste statistiske data er live totalvekt kyllinger, kalkuner, ender og andre slaktet fjørfe i USA 62,5 milliarder pounds per år¹; i EU er det ca 28.7 milliarder pounds per år. Vurderer fjær at opptil 8,5% av totale fjørfe vekten, produserer USA alene årlig ca 5.3 billion pounds av avfall fjær².

Keratin er et protein viser høy kjemisk motstand fordi det er sterkt krysskoblet med disulfidbroer som gjør behandlingen vanskelig. Få løselig produkter krever cleaving cross-links og muligens utføre hydrolyse av bundet³. Spalting av disulfidbroer kan gå gjennom en reaksjon på thiol anion etter følgende mønster^4,5:

S_en^– + -S_bS_c-↔-S_b^– + – S_enS_c^–

Med svært høy pH nivå vises hydrolyse av disulfidbroer også, i henhold til det mønster⁶

-SS^– , OH^– →-S^– ++ -SOH

Under mild forhold (pH ca 8) sted selv sulfitolysis finner etter følgende mønster:

-SS- + HSO₃^– →-SH + -SSO₃^–

Den mest økonomiske måten å nedverdigende keratin er mikrobiell sammenbrudd, som er preget av mild reaksjonen forhold under behandling og høy sammenbrudd effektivitet (ca 90%)^7,8. Keratinases er produsert av noen bakterier isolert fra jord og keratin avfall⁹. Mikrobiell keratinases hydrolyze stive og sterkt krysskoblet keratin strukturer¹⁰ og den resulterende KH forberedt er rik på fettløselige proteiner, uten tap av essensielle aminosyrer i det¹¹.

For å inkludere et protein i kosmetiske produkter (f.eks, emulsjoner, kremer og geler), sikre kravene at slike proteiner er løselig i vann, gitt systemene er gjennomsiktig, og den ny samlingen av peptider unngås grunn hydrofobe interaksjoner. Derfor er en vanlig praksis å bruke hydrolyserte av proteiner, som hydrolyzed kollagen og elastin keratin. Når du legger til hydrolyserte i kosmetisk emulsjoner, treffes tiltak for å sikre at hydrolysatet først oppløses i vann. I noen tilfeller er det ønskelig at protein (eller hydrolysatet) er oppløselig i alkohol eller andre organiske løsemidler¹².

KH er vanligvis omtalt i shampoos, conditioners, lotions og nutritive serum for håret, samt mascaras, neglelakk og øye make-up agenter. KH effektene erklært vanligvis inkluderer danner en beskyttende film, glatte ut håret eller struktur, økt plastisitet og utseendet på behandlet dannelsen, regulere konsistensen av produkter, og oppmuntre dannelsen av skum^{13 , 14}. det har også vist at KH reduserer overflatespenning, derav tilskudd i kosmetikk kan lette reduksjon i mengden emulgator legges til stabilisere kremer. KH begrense virkningene av irritasjon utløst av rengjøringsmidler (tensider) til hud, øyne og hår, dermed redusere eventuelle mulige bivirkninger av rengjøringsmidler på vev (f.eks, dehydrering av huden, hardhet og redusert barriere funksjon huden). Høy bufring evnen til hydrolyserte er også utnyttes til å stabilisere pH i kosmetikk; peptider kortere lengde har en større bufring effekt^15,16. Selv om KHs har blitt etablert som standard komponenter i håret og spiker kosmetikk samt utnyttet i produkter for hudpleie, studier på den fuktighetsgivende effekten av KH ikke vises i samtidens litteratur.

Alkalisk-enzymatisk teknologi er utviklet for å behandle keratin biprodukter i KH og aktiv testing pågår om virkningene av en rekke kosmetisk tilsetningsstoffer^{17,18,19,20 , 21 , 22}. fordelen med totrinns alkaliske-enzymatisk hydrolyse bruker mikrobiell proteaser for kylling fjær oppnår høy effektivitet under mild reaksjonen forhold og kvaliteten på KH er svært høy i motsetning til hydrolyse i sterke syrer eller alkalier. I den første fasen, er fjær ruges ved høyere temperatur i et alkalisk miljø, som delvis forstyrrer keratin strukturen og svulmer fjær; etter justere pH, er fjær hydrolyzed med et proteolytisk enzym under mild forhold i den andre fasen. Dialyzed KH har et høyt innhold av proteiner.

Metoden beskrevet her er behandling fjørfe fjær i en KH gjennom alkaliske-enzymatisk hydrolyse og teste effekten av fuktgivende egenskaper av KH på O/W kosmetisk emulsjon. De fuktighetsgivende egenskapene er undersøkt av instrumentale ikke-invasiv metoder i vivo. Hyppigste metoder for måling av huden fuktighet og barriere funksjon av SC inkluderer måle elektrisk eiendom av huden (konduktans eller kapasitans). Metoder for å undersøke SC hydration inkluderer nær infrarød multispectral forestille metoden (NIM), kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi, optical coherence tomografi eller forbigående termisk overføring²³. Barriere funksjon av SC korrelerer til TEWL av SC og den måles ventilert kammer metoden, uventilerte kammeret metoden og åpne kammeret metoden²⁴.

Egenskaper for modell formuleringer fastsettes ved hjelp av Multi sonde kortet MPA 5 med tre typer sonder. Den første one, corneometer CM 825, tiltak huden fuktighet ved å vurdere endringer i elektrisk kapasitet på hudens overflate; måle kondensatoren viser endringer i kapasitans av huden overflate i corneometric enheter. Corneometer gir bare en relativ vurdering av hud hydration²⁵. For TEWL brukes andre sonden, tewameter TM 300, for å måle tetthet gradient av fordampning (i en åpen kammer maskinen basert på Ficks diffusjon lov) fra huden indirekte av to par av sensorer (temperatur og relativ fuktighet) angir mengden av vann per en definert område og tid (g/m²h). Denne metoden kan oppdage selv den minste forstyrrelsen huden barriere funksjonen²⁶. Hudens pH er en indikator barriere og anti-mikrobielle funksjon av SC²⁷. Surheten av huden mantelen ble målt ved en (tredje) hud PH 905 proben er koblet MPA 5 stasjonen. Denne spesialdesignet sonde består av en flat-topped glass elektrode for full hudkontakt, koblet til et analogt voltmeter. Systemet måler mulige endringer på grunn av aktiviteten til hydrogen kasjoner rundt svært tynne lag av halvfaste skjemaer målt på toppen av sonden. Endringene i spenning vises som pH²⁸.

Vi presenterer eksperimenter delt i tre: (1) forberedelse av KH kylling fjær av totrinns alkaliske-enzymatisk hydrolyse og rensing sin av dialyse (fjerning salter og lav-molekylær brøker), (2) utarbeidelse av kosmetiske formuleringer som inneholder 2, 4 og 6% KH, og (3) Testing egenskapene til KH ved å måle hud hydration, TEWL, og huden pH. Tester ble utført på 10 kvinner med gjennomsnittlig alder på 27.2 år og 10 menn med middelalder 26.2 år. Metoden for å velge frivillige og testing selv ble utført i samsvar med internasjonale etiske prinsipper av bio-medisinske forskning utnytte mennesker²⁹; alle personer ga sitt samtykke før inkludering i studien. Før testing startet, frivillige ble bedt om å fylle ut et spørreskjema på deres helsetilstand. De frivillige forpliktet til å unngå å bruke kosmetiske produkter til test nettsteder og omkringliggende områder under 24 h før og under testperioden; Videre var de bare tillatt kort kvelden vasker med rennende vann.

Protocol

Frivillige ble rekruttert blant ansatte og studenter ved vårt universitet. Metoden for valg ble gjennomført i henhold til “internasjonale, etiske retningslinjer for biomedisinsk forskning involvering forsøkspersoner. Rådet for internasjonale organisasjoner i medisinske fag, Genève (2002).” KH er en vanlig kosmetisk ingrediens brukt i hårpleie produkter (sjampo, balsam, etc.) og dermed godkjenning fra institusjonelle gjennomgang styret er ikke nødvendig. 1. prosessen kylling fjæ…

Representative Results

KH utarbeidet etter prosedyren presenteres her (se figur 2) er gul i fargen, lett løselig i vann med høy proteininnhold (uorganiske faste stoffer representerer < 2.0%), pH i 1,0% løsning av KH er 5.3, og oppfyller kravene for kosmetisk førsteklasses hydrolyserte. Avkastningen av KH fra 50 g råvarer er ca 30%. Molekylvekt fordelingen av KH ble bestemt av SDS-side og vises i Figur 3. <p class="jove_content" fo:keep-togethe…

Discussion

Fordelen alkaliske-enzymatisk hydrolyse er at det kan endres etter fremtidige anvendelser av KH. For eksempel i hårpleie kosmetikk programmer der en lett brunlig farge produktet ikke er et hinder, kan en høyere temperatur i hydrolyse brukes fører til en høyere avkastning av KH. I tillegg til lengre behandlingstid under begge trinn av teknologiske prosedyren påvirker betydelig dataregistreringsfeil effektivitet-avkastning av KH stiger til 85%.

Resultatene for hydration måling gjør det ty…

Materials

Material or chemicals
LIPEX 100T	Novozymes	LJP30020	Lipex – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L	Novozymes	PXN40001	Savinase – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g
Potassium hydroxide, KOH	Sigma-Aldrich	302510289	Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11
Phosphoric acid solution, H3PO4	Sigma-Aldrich	W290017	Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00
Sodium chloride physiological solution	Sigma-Aldrich	52455	Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl
Sodium hydroxide, NaOH	Penta s.r.o.	40216	Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00
AmiFarm (Cremor base-A)	Fagron	608425	Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers	IKA-labortechnik	Z404020	Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs
IKA Propeller stirrer, 3-bladed	IKA-labortechnik	R 1381	Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm
Dialysis tubing closures	Sigma-Aldrich	Z371017-10EA	Dialysis tubing closures, red, size 110 mm
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9402-100FT	Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.)
DOMO Pot with stailess, LCD	DOMO Elektronic	DO42325PC	Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display
Hettich zentrifugen Universal 32	Gemini bv	2770 GS1R	Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm
LT 3 shaking device	Fischer Scientific	6470.0002	Orbital shaking device
KERN 440-47N	Kern	440-47N	Laboratory balance
KERN 770	Kern	770 -N	Laboratory analytical balance
VENTICELL 222 – Komfort	BMT, MMM Group	C 131749	Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control
Vacucell 55 – EVO	BMT, MMM Group	B 050328	Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C
PULVERISETTE 19	Fritsch	19.1030.00	Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives
Multi Probe Adapter System MPA 5	Courage & Kazaka Electronic	10225237	MPA 5 Station – equipment for measurement hydratation, TEWL and pH
Skin pH-meter PH 905 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp
Corneometer CM 825 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum).
Tewameter TM 300	Courage & Kazaka Electronic		Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL)
Heidolph RZR 2020	Heidolph	13-225-007-03-1	Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm
Heidolph mechanical stirrer BR 10	Heidolph	Z336688-1EA	Blade impeller crossed stirrer
Fagor FS 12	Fagor	BTT-138	Laboratory refrigerator with freezer space
WTW bench pH/mV meter	WTW	Z313165	High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories
Container	RPC Superfos		13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microsoft Office 2010	Microsoft
C+K software	Courage and Khazaka Electronic GmbH		MPA 5 station operating software