Preparazione di idrolizzato di cheratina da piume di pollo e la sua applicazione nei cosmetici

Summary

L’obiettivo del protocollo è di preparare idrolizzato di cheratina da piume di pollo per idrolisi alcalina-enzimatica e di verificare se l’aggiunta di idrolizzato di cheratina in una base dell’unguento di cosmetici migliora la funzione barriera della pelle (intensificazione idratazione e diminuendo la perdita d’acqua transepidermica). I test sono condotti su uomini e donna volontari.

Abstract

Idrolizzati di cheratina (KHs) sono componenti standard stabiliti nella cosmesi dei capelli. Comprensione degli effetti idratanti di KH è vantaggiosa per i cosmetici cura della pelle. Gli obiettivi del protocollo sono: (1) piume di pollo in KH tramite idrolisi alcalina-enzimatica e purificarla da dialisi e (2) verificare se l’aggiunta di KH in una base di unguento (OB) aumenta l’idratazione della pelle e migliora la funzione barriera della pelle, diminuendo perdita di acqua transepidermica (TEWL). Durante l’idrolisi alcalina-enzimatica piume vengono incubate in primo luogo ad una temperatura superiore in un ambiente alcalino e quindi, in condizioni blande, idrolizzate con enzima proteolitico. La soluzione di KH è dializzata, vuoto essiccato e macinato ad una polvere fine. Formulazioni cosmetiche composto da emulsione olio in acqua (O/W) contenenti 2, 4 e 6% di peso di KH (basato sul peso dell’OB) sono preparati. Prova le proprietà idratanti di KH è effettuata su 10 uomini e 10 donne a intervalli di tempo di 1, 2, 3, 4, 24 e 48 h. testato formulazioni sono distribuite a siti sgrassati avambraccio volar. L’idratazione dello strato corneo (SC) è valutata misurando la capacità della pelle, che è uno dei metodi più universalmente usati e semplici. TEWL si basa sulla misurazione della quantità di acqua trasportati a una zona definita e il periodo di tempo dalla pelle. Entrambi i metodi sono completamente non-invasiva. KH costituendo un’occlusiva eccellente; a seconda l’aggiunta del KH in OB, determina una riduzione del 30% in TEWL dopo l’applicazione. KH funziona anche come un umettante, come esso lega l’acqua dagli strati inferiori dell’epidermide al Comitato di vigilanza; all’aggiunta di KH ottima nell’OB, fino al 19% aumento dell’idratazione negli uomini e 22% aumento nelle donne si verifica.

Introduction

Macelli, l’industria alimentare e l’industria conciaria produrre annualmente immense quantità di sottoprodotti solidi cheratina – lana, piume, setole, zoccoli, artigli, corna e simili. Secondo dati statistici più recenti, il peso vivo totale di polli, tacchini, anatre e altri volatili da cortile macellati negli Stati Uniti è 62,5 miliardi sterline l’anno¹; nell’UE è circa 28,7 miliardi sterline l’anno. Considerando che le piume rendono fino all’8,5% del peso totale di pollame, gli Stati Uniti da solo produce annualmente circa 5,3 miliardi di chili di rifiuti piume².

La cheratina è una proteina che esibisce la resistenza chimica perché è fortemente reticolato con ponti disolfuro che rendono difficile l’elaborazione. Ottenere prodotti solubili richiede legami incrociati di sfaldatura e possibilmente svolgimento idrolisi dei legami peptidici³. Scissione dei ponti disolfuro può procedere attraverso una reazione dell’anione del tiolo secondo il seguente modello^4,5:

S_un^– + – S_bS_c– ↔ – S_b^– + – S_aS_c^–

Con un livello di pH molto elevato, appare anche idrolisi dei ponti disolfuro, in conformità con il modello⁶

SS –^– + → OH^– – S^– – SOH

In condizioni blande (pH circa 8), anche sulfitolysis si svolge secondo il seguente modello:

– SS – + → di HSO₃^– – SH + – SSO₃^–

Il modo più economico di degradante cheratina è ripartizione microbica, che è caratterizzata da condizioni di reazione delicata durante la lavorazione e alta ripartizione efficienza (circa 90%)^7,8. Keratinases sono prodotte da alcuni batteri isolati dal suolo e cheratina rifiuti⁹. Keratinases microbica idrolizzare cheratina rigida e fortemente reticolato strutture¹⁰ e il risultante KH preparato è ricco in proteine solubili, senza perdita di aminoacidi essenziali rilevato in esso¹¹.

Per incorporare una proteina nelle preparazioni cosmetiche (ad es., emulsioni, lozioni e gel), i requisiti di garantiscono che tali proteine sono solubili in acqua, sistemi specificati sono trasparenti e che ri-aggregazione dei peptidi è evitato a causa interazioni idrofobiche. Di conseguenza, una pratica comune consiste nell’applicare gli idrolizzati di proteine, quali collagene idrolizzato, elastina e cheratina. Quando si aggiungono gli idrolizzati in emulsioni cosmetiche, sono misure per garantire che l’idrolizzato in primo luogo è dissolto in acqua. In alcuni casi, è auspicabile che la proteina (o l’idrolizzato) è solubile in alcool o altri solventi organici¹².

KH è normalmente presenti in shampoo, balsami, lozioni e nutritive sieri per i capelli, così come mascara, smalto e agenti di trucco dell’occhio. Gli effetti KH dichiarati solitamente includono formando una pellicola protettiva, lisciare i capelli o unghie struttura, maggiore plasticità e l’aspetto della formazione trattata, regolando la consistenza dei prodotti e incoraggiare la formazione di schiuma^{13 , 14}. Inoltre è stato dimostrato che KH riduce la tensione superficiale, quindi il completamento nei prodotti cosmetici può facilitare la riduzione della quantità di emulsionante aggiunto per stabilizzare creme. KH limitare gli effetti di irritazione innescato da detergenti (tensioattivi) di pelle, occhi e capelli, riducendo così eventuali potenziali effetti collaterali dei detergenti sul tessuto (ad es., disidratazione della pelle, durezza e funzione di barriera in diminuzione di la pelle). L’elevata capacità di buffer di idrolizzati viene sfruttata anche per stabilizzare il pH dei cosmetici; peptidi di lunghezza inferiore hanno un buffer maggiore effetto^15,16. Anche se KHs hanno affermato come componenti standard in capelli e cosmetici delle unghie così come viene utilizzato nei prodotti per la cura della pelle, studi sugli effetti idratanti di KH non compaiono nella letteratura contemporanea.

Tecnologia alcalina-enzimatica è stata sviluppata per la trasformazione di sottoprodotti di cheratina in KH, e prova attiva è in corso sugli effetti di un certo numero di additivi cosmetici^{17,18,19,20 , 21 , 22}. il vantaggio di idrolisi alcalina-enzimatica bistadio, facendo uso delle proteasi microbiche per piume di pollo raggiunge ad alta efficienza in condizioni di reazione delicata e la qualità di KH è molto alta in contrasto con idrolisi impiegati in acidi forti o alcali. Nella prima fase, le piume vengono incubate a una temperatura più alta in un ambiente alcalino, che parzialmente distrugge la struttura cheratinica e gonfia le piume; Dopo aver regolato il pH, le piume sono idrolizzate con un enzima proteolitico in condizioni blande nella seconda fase. Il KH dializzato possiede un alto contenuto di proteine.

Le finalità del metodo descritto qui sono trasformazione piume di pollame in un KH attraverso idrolisi alcalina-enzimatica e verificare l’effetto di proprietà idratanti di KH applicato a emulsione cosmetica O/W. Proprietà idratanti sono indagate dal strumentale metodi non invasivi in vivo. I metodi più frequenti per misurare la funzione della pelle idratazione e barriera di SC includono proprietà elettriche della pelle (conduttanza o capacità) di misura. Diversi metodi per indagare idratazione SC includono vicino infrarosso metodo immaginando multispettrale (NIM), spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, tomografia ottica di coerenza o trasferimento termico transitorio²³. Funzione barriera dello SC è correlata alla TEWL di SC e si misura con il metodo di camera ventilata, camera non ventilata e camera aperta metodo²⁴.

Proprietà delle formulazioni modello sono determinati utilizzando l’adattatore sonda Multi 5 MPA con tre tipi di sonde. Il primo uno, corneometer CM 825, idratazione della pelle misure valutando cambiamenti nella capacità elettrica della superficie della pelle; il condensatore di misura Mostra cambiamenti nella capacità della superficie della pelle in corneometric unità. Il corneometer dà solo una relativa valutazione di pelle idratazione²⁵. Per la TEWL, la seconda sonda, tewameter TM 300, è utilizzata per misurare la pendenza di densità di evaporazione dell’acqua (in uno strumento di camera aperta basato sulla legge di diffusione di Fick) dalla pelle indirettamente da due coppie di sensori (temperatura e umidità relativa) che indica la quantità di acqua trasportata per una zona definita e il periodo di tempo (g/m2/h). Questo metodo può rilevare anche la minima interruzione di pelle barriera funzione²⁶. PH della pelle è un indicatore della barriera e funzione anti-microbica dell’ SC²⁷. L’acidità del manto della pelle è stata misurata da una sonda di pelle PH 905 (terza) collegata alla stazione di 5 MPA. Questa sonda appositamente progettato è costituita da un elettrodo di vetro piatte per contatto cutaneo completo, collegato ad un voltmetro. Il sistema di misura potenziali cambiamenti dovuti all’attività dei cationi di idrogeno che circonda lo strato molto sottile di forme semi-solide misurata nella parte superiore della sonda. I cambiamenti nella tensione vengono visualizzati come pH²⁸.

Vi presentiamo gli esperimenti divisi in tre sezioni: (1) preparazione del KH da pollo piume di idrolisi alcalina-enzimatica bistadio e sua purificazione tramite dialisi (rimozione di sali e frazioni a basso peso molecolare), (2) la preparazione di cosmetici le formulazioni contenenti 2, 4 e 6% KH e (3) verifica delle proprietà di KH misurando idratazione, TEWL, della pelle e della pelle pH. Prova è stata effettuata su 10 donne con l’età media di 27,2 anni e su 10 uomini con età media di 26,2 anni. Il metodo di selezione dei volontari e le prove stesse sono state condotte in conformità con i principi etici internazionali di ricerca bio-medica che utilizza soggetti umani²⁹; tutte le persone hanno dato il loro consenso informato prima dell’inclusione nello studio. Prima della prova ha cominciato, i volontari è sono chiesto di compilare un questionario sul loro stato di salute. I volontari impegnati per evitare di applicare qualsiasi prodotto cosmetico per i siti di prova e le regioni circostanti durante le 24 ore prima di e durante il periodo di prova; Inoltre, sono stati consentiti solo breve sera lavaggi con acqua corrente.

Protocol

I volontari sono stati reclutati tra i collaboratori e gli studenti del nostro Ateneo. Il metodo di selezione è stata condotta secondo “linee guida etiche internazionali per Biomedical Research coinvolgere soggetti umani. Del Consiglio per le organizzazioni internazionali delle scienze mediche, Ginevra (2002).” KH è un comune ingrediente cosmetico utilizzato in prodotti per capelli (shampoo, balsami, ecc.) e quindi non è necessaria l’approvazione dal Consiglio di revisione istituzionale. <p class="jove_t…

Representative Results

Il KH preparato secondo procedura presentata qui (Vedi Figura 2) sono di colore giallo a colore, facilmente solubile in acqua con alto contenuto proteico (solidi inorganici rappresentano < 2,0%); il pH della soluzione 1,0% di KH è 5.3 e soddisfa i requisiti per cosmetici-grado idrolizzati. La resa di KH da 50 g di materia è circa 30%. Distribuzione del peso molecolare di KH è stata determinata mediante SDS-PAGE ed è illustrata nella F…

Discussion

Il vantaggio di idrolisi alcalina-enzimatica è che può essere modificato secondo le applicazioni future di KH. Ad esempio, nelle applicazioni di cosmetica cura dei capelli dove un colore leggermente brunastro di un prodotto non è un ostacolo, una temperatura più alta nell’idrolisi può applicarsi che conduce ad un più alto rendimento di KH. Inoltre, il più lungo tempo di elaborazione durante entrambe le fasi del procedimento tecnologico influenza in modo significativo il processo di complessivo efficienza – rendi…

Materials

Material or chemicals
LIPEX 100T	Novozymes	LJP30020	Lipex – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L	Novozymes	PXN40001	Savinase – enzyme produced by submerged fermentation of a genetically-modified microorganism, activity 16 KNPU-S/g
Potassium hydroxide, KOH	Sigma-Aldrich	302510289	Potassium hydroxide, KOH, 97,0 %, Mr 56,11
Phosphoric acid solution, H3PO4	Sigma-Aldrich	W290017	Phosphoric acid solution, H3PO4, 85 wt. % concentration in water, Mr 98,00
Sodium chloride physiological solution	Sigma-Aldrich	52455	Tablets of BioUltra NaCl physiological solution; 1 tablet in 1000 mL of water yields 0.9 % NaCl
Sodium hydroxide, NaOH	Penta s.r.o.	40216	Sodium hydroxide, NaOH, 97,0 %, Mr 40,00
AmiFarm (Cremor base-A)	Fagron	608425	Hydrophilic oil in water (O/W) cream base; the composition: aqua, paraffin, paraffin liquid, cetearyl alkohol, Laureth 4, sodium hydroxide, carbomer, methylparaben, propylparaben.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
IKA EUROSTAR POWER control-visc stirrers	IKA-labortechnik	Z404020	Digital laboratory stirrer, for tasks up to the high viscosity range, 230V, 1/cs
IKA Propeller stirrer, 3-bladed	IKA-labortechnik	R 1381	Propeller stirrer, 3-bladed, stirrer Ø: 45 mm, shaft Ø: 8 mm, shaft length: 350 mm
Dialysis tubing closures	Sigma-Aldrich	Z371017-10EA	Dialysis tubing closures, red, size 110 mm
Dialysis tubing cellulose membrane	Sigma-Aldrich	D9402-100FT	Dialysis tubing cellulose membrane, average flat width 76 mm (3.0 in.)
DOMO Pot with stailess, LCD	DOMO Elektronic	DO42325PC	Preserving boiler stainless steel, 2000 W, 27-L container (diameter 37 cm, height 30 cm), temperature control 30-100 ° C, operation LCD display
Hettich zentrifugen Universal 32	Gemini bv	2770 GS1R	Mid bench centrifuge, speed 18000 rpm
LT 3 shaking device	Fischer Scientific	6470.0002	Orbital shaking device
KERN 440-47N	Kern	440-47N	Laboratory balance
KERN 770	Kern	770 -N	Laboratory analytical balance
VENTICELL 222 – Komfort	BMT, MMM Group	C 131749	Drying oven, temperature control 30-100 ° C, air circulation control
Vacucell 55 – EVO	BMT, MMM Group	B 050328	Vacuum drying oven, temperature control 30-100 ° C
PULVERISETTE 19	Fritsch	19.1030.00	Universal cutting mill, rotor with V-cutting edges and fixed knives
Multi Probe Adapter System MPA 5	Courage & Kazaka Electronic	10225237	MPA 5 Station – equipment for measurement hydratation, TEWL and pH
Skin pH-meter PH 905 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to specifically measure the pH on the skin surface or the scalp
Corneometer CM 825 probe	Courage & Kazaka Electronic		Probe to determine the hydration level of the skin surface (Stratum corneum).
Tewameter TM 300	Courage & Kazaka Electronic		Probe for the assessment of the transepidermal water loss (TEWL)
Heidolph RZR 2020	Heidolph	13-225-007-03-1	Overhead stirrer, mechanical speed setting and stepless transmission; speed range 40-2000 rpm
Heidolph mechanical stirrer BR 10	Heidolph	Z336688-1EA	Blade impeller crossed stirrer
Fagor FS 12	Fagor	BTT-138	Laboratory refrigerator with freezer space
WTW bench pH/mV meter	WTW	Z313165	High-performance bench pH and pH/conductivity meters for routine and high precision laboratory measurements in research or quality control laboratories
Container	RPC Superfos		13-L plastic bucket, diameter 26 cm, height 26 cm
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Microsoft Office 2010	Microsoft
C+K software	Courage and Khazaka Electronic GmbH		MPA 5 station operating software