Produktion av genmanipulerade gyllene syriska hamstrar genom pronukleär injektion av CRISPR/Cas9 komplexet
Summary
Pronukleär (PN) injektion av den klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) och CRISPR-associerade protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system är en mycket effektiv metod för att producera genetiskt modifierade gyllene syriska hamstrar. Häri, beskriver vi detaljerad PN injektion protokollet för produktion av genen knockout hamstrar med CRISPR/Cas9-systemet.
Abstract
Den pronukleär (PN) injektionstekniken fastställdes först hos möss att införa främmande genetisk material i pronuclei one-cellstadie embryon. Det införda genetiska materialet kan integrera i embryonala genomet och generera transgena djur främmande genetisk information efter överföring av de injicerade embryona för att främja mödrar. Efter framgångarna i möss, PN injektion har tillämpats framgångsrikt i många andra djurarter. Nyligen, PN injektion har lyckat använts att införa reagenser med gen-ändra aktiviteter, såsom CRISPR/Cas9 system att uppnå platsspecifika genetiska modifikationer i flera laboratorium samt djurarter. Förutom att behärska den speciella uppsättningen Mikroskop färdigheter att producera genetiskt modifierade djur genom PN injektion, måste forskare förstå de reproduktion fysiologi och beteende målarter, eftersom varje art presenterar unika utmaningar. Exempelvis gyllene syriska hamster embryon har unik hantering krav för in vitro- sådan att PN injektionstekniker inte var möjliga i denna art tills senaste genombrott av vår grupp. Med våra arter-modifierade PN injektion protokoll, har vi lyckats producera flera gen knockout (KO) och knockin (KI) hamstrar, som har använts framgångsrikt till modell mänskliga sjukdomar. Beskriver här vi PN injektionsproceduren för att leverera den CRISPR/Cas9 komplexa till zygoter hamster, embryo hantering villkor, embryo transfer förfaranden och djurhållning som krävs för att producera genetiskt modifierade hamstrar.
Introduction
Den gyllengula syriska hamstern (Mesocricetus auratus) är en av de mest använda gnagarna för biomedicinsk forskning. Enligt US Department of Agriculture användes ungefärligt 100.000 hamstrar i USA under 2015, vilket motsvarar 13% av totala laboratorium djur användning bland de arter som omfattas av djurskyddslagen (http://www.aphis.usda.gov; nås 10 mars 2017).
Hamster erbjuder flera fördelar jämfört med andra gnagare i studien av ett antal mänskliga sjukdomar. Exempelvis de histopatologi N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) inducerad pankreas duktal adenokarcinom i hamster är liknande till människors Pankreastumör, medan BOP behandling främst inducerar sköldkörteln tumörer hos råttor och lung och levertumörer hos möss1. Eftersom hamstrar är endast små gnagare hittade för att stödja replikering av adenoviruses, är de också modellen av val för att testa adenovirus-baserade onkolytisk vektorer och anti adenovirus droger2,3,4. Ett annat exempel vari hamster modellen erbjuder en fördel över möss och råttor är i studien av hyperlipidemi. Människor och hamstrar uppvisar stora likheter i lipid metaboliska vägar och båda arter bära den gen som kodar cholesteryl ester transfer protein (CETP), som spelar en central roll i lipid metabolismerna, medan CETP är frånvarande i möss och råttor5. Dessutom utveckla hamstrar hemorragisk sjukdom mer representativt av den mänskliga manifestation efter exponering för Ebola virus6. Hamstrar är också modeller av val för att studera ateroskleros7, muntliga carcinom8och inflammatoriska myopatier9. Nyligen har visats det också att hamstrar är mycket mottagliga för Anderna virusinfektion och utveckla hantavirus pulmonella syndrom-liknande sjukdom, ger den endast gnagare modellen av Anderna virus infektion10.
För att lösa otillfredsställda behov av nya genetiska djurmodeller studera de mänskliga sjukdomar där ingen pålitlig liten gnagare modell är tillgängliga, vi nyligen lyckats tillämpar CRISPR/Cas9 systemet till hamstern och har producerat flera rader av genetiskt bakåtkompilerade hamstrar11. Hamster zygoter är mycket känsliga för miljömässiga miljöer så att de PN injektion protokoll som utvecklats i andra arter är olämpliga. Därför utvecklade vi en PN injektion protokoll för hamster som rymmer de särskilda krav för hantering av hamster embryon in vitro. Här beskriver vi detaljerad PN injektionsproceduren med CRISPR/Cas9 systemet och medföljande stegen, från beredning av enda guide RNA (sgRNA) till överföringen av injicerade embryon till mottagarens honor.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att bättre utnyttja möjligheter som gyllene syriska hamstrar som modeller för humana sjukdomar, utvecklade vi ett PN injektion protokoll för att leverera en CRISPR/Cas9 komplexa för att rikta hamster genomet. PN injektion protokollet optimerar flera viktiga variabler inklusive embryo odlingsmedium, temperatur och våglängder av ljus13. Det finns också flera hamster-specifika djurhantering förfaranden som måste följa för att framgångsrikt bedriva gen inriktning i hamster. Exempelvi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av de nationella institut för allergi och smittsamma sjukdomar (NIAID) av det nationella Institutes of Health under award nummer 1R41OD021979 (till ZW) och ett forskningsanslag från nästa generations BioGreen 21 Program, Republiken Korea, bevilja nr. PJ01107704 (till ZW) och bevilja nr. PJ01107703 (till IK). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health eller BioGreen 21. Vi tackar Dr. Nikolas Robl för redigering manuskriptet.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
Riferimenti
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three–Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
