遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション
Summary
CRISPR/Cas9 システムを用いたチャネル ナマズ胚の遺伝子を編集するための簡単かつ効率的なマイクロインジェクション プロトコルが表示されます。このプロトコルでは Rna、ガイドし、Cas9 蛋白質は 1 細胞期胚の卵黄に microinjected いた。このプロトコルは、2 つのチャネル ナマズ免疫関連遺伝子をノックアウトによって検証されています。
Abstract
アメリカナマズ遺伝子機能を勉強する大きな機会につながる、アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイの完全なゲノムが配列されています。遺伝子ノックアウトは、これらの遺伝子機能の生体を研究に使用されています。クラスター化された定期的に空間短い回文の繰り返し/CRISPR 関連付けられている蛋白質 9 (CRISPR/Cas9) システムは、遺伝子の機能を変更するゲノム DNA 配列を編集するための強力なツールです。従来のアプローチは、マイクロインジェクションによる単一細胞期胚に CRISPR/Cas9 mRNA を導入してきましたが、ナマズの遅く、非能率的なプロセスをすることができますこの。ここでは、CRISPR/Cas9 蛋白質とアメリカナマズ胚のための詳しいプロトコルを説明します。簡潔に、卵子と精子は、収集し、人工受精を実行をだった。受精卵は、Holtfreter のソリューションを含むペトリ皿に移されました。注入量が校正され、ガイド Rna/Cas9 ターゲット フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプター分子 (TICAM 1) 遺伝子とラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子は 1 細胞期胚の卵黄に microinjected いた。オクターリピートされた DNA の配列によって確認された遺伝子ノックアウトに成功しました。これらの突然変異のための予測された蛋白質シーケンス変更フレーム シフトを含めるし、時期尚早停止コドンによる蛋白質を切り捨ています。
Introduction
マイクロインジェクション、細胞または胚ガラス毛管1を DNA、RNA、タンパク質、および他の高分子などの物質の少量を提供するために使用一般的な検査手法です。インジェクションは、マイクロ、マイクロマニピュレーター、顕微鏡2など特別な機器セットアップを使用して実行されます。手法は、遺伝子を通じて世代遺伝子組み換え、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子療法の細胞内構成要素3,4のダイナミクスを理解することを目的とする生物の多くを変更するのには研究者によって使用されています,5。
アメリカナマズ (Ictalurus イシガキダイ) は養殖に最も人気のあるナマズの種とアメリカ合衆国の遊漁船活動。チャネル ナマズの機能ゲノミクスの研究がますます必要あり、アメリカナマズの完全なゲノムの配列ゲノム編集ツール6、7の最近の進歩の有用性を高めます。遺伝子機能の理解だけはナマズ、実施されている研究の充実がないが、ナマズ産業を強化するより効果的な遺伝的改良プログラムにも 。興味の特定の特性の重要な遺伝子を特定すると、遺伝的有利な対立遺伝子を生成するゲノム編集によるナマズ生産を転送する、有害な対立遺伝子を抑制すること、これらの対立遺伝子の選択を改善するために使用できます。遺伝子導入、またはこれらのオプションのいくつかの組み合わせを有利な対立遺伝子。1 つの魚の種から商業的に有益な特性の異なる最高の遺伝子を組み合わせることによって、生産性と収益性魚生産操作8を大幅向上させるでしょう。
遺伝子ノックアウトは、遺伝子機能の生体を研究する直接法です。DNA レベルでの突然変異は、さまざまな世代の効果の研究を容易にする将来の世代に継承されます。異なるゲノム編集ツール開発含む亜鉛指核酸 (ZFNs)、転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) して定期的に空間短い回文繰り返し/CRISPR 関連タンパク質 9 (CRISPR/Cas9 をクラスター化) システム9,10、11,12。
CRISPR/Cas9 システムから RNA 誘導部位特異的 DNA 胸の谷間5,13魚の遺伝子ノックアウトを含むゲノムの DNA 配列を編集する使用されている強力な効率的なツールです。システムは、ゲノム DNA エンドヌクレアーゼ酵素、Cas9 で対象のシーケンスを決定するガイド RNA (gRNA) で構成されます。ZFNs と TALENs 上のいくつかの利点とのゲノムの任意のシーケンスをターゲットに CRISPR/Cas9 システムを設計することができます: (1) 低コスト (2) 簡単に工学ガイド RNA ターゲット シーケンスに結合した (3) より特定化したターゲットを突然変異 (4)複数のシーケンスが変更されません TALENs とまでの変異の (6) の改善された生殖伝送速度 6-fold ZFNs と TALENs14と比較した場合の遺伝子の同じ時間 (5) 高い突然変異率の異なる gRNA の対象になることができます。 15,16,17,18。
マイクロインジェクションの主な方法として、エレクトロポレーション、電気衝動が胚又は細胞膜の透過性と生体分子19,20の吸収を高めるために適用されます。いくつかの遺伝子導入魚はメダカ (メダカ)、ゼブラフィッシュ (動脈分布)、マスノスケ (オンコルヒュンクス ・ tshawytscha)、アメリカナマズ、鯛 (Sparus sarba) などのエレクトロポレーションを使用して生成された、一般的な鯉 (コイ)21,22,23,24,25,26。
エレクトロポレーションは遺伝子ノックアウトのプラスミド Cas9 の DNA、RNA および蛋白質を提供する使用されています。哺乳類セルの Cas9/gRNA プラスミド DNA Cas9 mRNA/gRNA、および Cas9 タンパク質/gRNA 複合体は、エレクトロポレーションを使用して配信され、突然変異誘発率はほとんどエレクトロポレーション テスト条件27Cas9 蛋白質/gRNA 錯体を用いた最高だった。マボヤ脊索動物 (ユウレイボヤ)、TALENs の構造を表現する複数の遺伝子28のノックアウトを誘発する受精卵に electroporated だった。ZFNs プラスミドの構成要素表現されたアメリカナマズ29黄体形成ホルモンをノックアウトする electroporated。ただし、一度細胞に導入し、プラスミドの構造必要があります RNA に転写、RNA のマイクロインジェクションに比べて突然変異誘発の時間を遅らせる可能性が高い目的の DNA シーケンスをターゲットすることができます前に機能性タンパク質に変換/タンパク質。胚の開発は、遅延変異は注入された創設者のモザイクを増加します。さらに、遺伝子組換え発現はマイクロインジェクション、変異導入効率を下げることで発現レベルを達成する可能性はありません。
細胞にゲノム編集ツールを導入するための手段としてマイクロインジェクション エレクトロポレーションにいくつかの利点があります。ゲノムの分子の編集は、細胞または胚マイクロインジェクション30を確実に導入できます。以下の注入材料が必要です。注入される材料の量を決定するは簡単です。高い突然変異の創始者魚における低モザイクでレートすることができます達成 F1変異の生殖を改善するでしょう。創始者の少ない魚は高い突然変異率のための最初の世代を作り出すために分析される必要があります。エレクトロポレーションで創設者のより多くの魚は、コストが増加分析する必要。ただし、アメリカナマズ microinjected 胚の生存はより多くの胚31,32を注入することによってこれを克服するのに electroporated のものより低い。アメリカナマズ、16 〜 55%、対象遺伝子によって卵黄 microinjected 胚の生存、gRNA/Cas9 蛋白質32の投与量。
ナマズ胚の正規のインジェクションは技術的に難しく、時間がかかり、ただし、迅速かつ効率的な CRISPR/Cas9 蛋白質マイクロインジェクション プロトコルが表示チャネル ナマズ胚のため。このプロトコルでは、1 つの細胞胚の卵黄に CRISPR/Cas9 タンパク質溶液を注入するので以下の時間と専門知識が必要です。受精卵の数百は、1 h (約が発生する最初の細胞分裂に必要な時間) で注入することができます。プロトコルを検証するため、2 つ病感受性関連遺伝子はアメリカナマズ、フリー ダイヤル/インターロイキン 1 受容体ドメインを含むアダプターの分子 (TICAM1) 遺伝子、ラムノース結合レクチン (RBL) 遺伝子のノックアウトされました。TICAM 1 は、toll 様受容体 (TLR) 3 によって開始されたシグナル伝達経路に関与しています。TICAM 1 チャネル ナマズのE. ictaluri33耐性種、青ナマズのダウンレギュ レートであった細菌愛媛 ictaluri課題、次亢進していた劇的に。RBL は、病菌 columnareカラムナリス病の病原の感染初期で重要な役割を果たしている、急性と堅牢なアップレギュレーションに比べてカラムナリス病感受性チャネル ナマズの緊張で記録された、カラムナリス病耐性株34。
Protocol
Representative Results
Discussion
遺伝子ノックアウトを達成するためにチャネル ナマズ胚のための詳しいプロトコルが提示されました。卵黄の CRISPR/Cas9 蛋白質の注入ははるかに簡単、時間を節約、ほとんど遺伝子導入や遺伝子編集魚の一般的な手法である一の細胞胚の blastodisc を microinjecting と比較した場合の広範なトレーニングを必要としません。30,42。 現在のプロトコルはア?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国農務省-NIFA 賞 2015 67015 23488 ロジャー ・ コーンによって賄われていた。著者は博士ロナルド ・ フェルプスのビデオでひなの銘柄選択基準の説明をありがちましょう。Ahmed Elaswad とカリム大同博士研究を資金調達のためワシントン DC のエジプト文化および教育局を感謝したいと思います。
Materials
| Reproboost implant | Center of Marine Biotechnology | Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5%, sterile filtered |
| Stereo microscope | Olympus | 213709 | For visualizing the eggs during microinjection |
| Microinjector | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MPPI-3 | For the delivery of the injection material into the embryos |
| Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MM33 | For holding and controlling the movement of the injection needle. |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | For loading injection solution into microinjection needles. |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 720 | For pulling microinjection needles |
| Cas9 protein | PNA Bio Inc. | CP01 | Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes. |
| Expand High FidelityPLUS PCR System | Roche Diagnostics, USA | For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation | |
| Borosilicate glass capillaries | Fisher Scientific | 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles. | |
| Petri dish | VWR | 25384-302 | For holding the embryos during the microinjection. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. | |
| Holtfreter`s solution | Home Made | 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. | |
| Doxycycline hyclate USP (monohydrate) | Letco Medical | 690904 | Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections. |
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