अंग प्रत्यारोपण में एचएलए Alloantibodies का पता लगाने के लिए निजीकृत पेप्टाइड सरणियों
Summary
अंग दाता और प्राप्तकर्ता जोड़े के बीच मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) अनुक्रम में बेमेल अंग प्रत्यारोपण में एंटीबॉडी की मध्यस्थता अस्वीकृति का प्रमुख कारण हैं । यहां हम कस्टम प्रतिजन arrays कि व्यक्तिगत दाताओं ‘ एचएलए अनुक्रम के आधार पर जांच विरोधी दाता एचएलए alloantibodies अंग प्राप्तकर्ताओं में कर रहे है के प्रयोग प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
अंग प्रत्यारोपण में, समारोह और भ्रष्टाचार की लंबी उंर गंभीर मानव ल्युकोसैट एंटीजन (एचएलए) के खिलाफ प्रतिरक्षा अस्वीकृति जेट को नियंत्रित करने की सफलता पर निर्भर करते हैं । Histocompatibility दिशानिर्देश एंटी-एचएलए प्रतिरक्षण के प्रयोगशाला परीक्षणों पर आधारित होते हैं, जो या तो पूर्व-मौजूदा या de नोवो जनित एचएलए एंटीबॉडी के रूप में प्रस्तुत करते हैं जो एक प्रमुख प्रत्यारोपण बाधा का गठन करते हैं । वर्तमान परीक्षण एक एकल-प्रतिजन मोतियों (सब) मंच पर निर्मित कर रहे है का एक निश्चित सेट का उपयोग कर ~ १०० अचयनित संयोजक एचएलए एंटीजन प्रत्यारोपण सीरा जांच करने के लिए । हालांकि, मनुष्यों में वहां एचएलए प्रकार की एक बहुत अधिक विविधता मौजूद है, कोई दो समान जुड़वां जो एचएलए दृश्यों का एक ही संयोजन साझा कर सकते है के अलावा अंय व्यक्तियों के साथ । जबकि एचएलए टाइपिंग और प्रत्यक्ष अनुक्रमण के लिए उंनत प्रौद्योगिकियों ठीक एक दाता और प्राप्तकर्ता के एचएलए, सब परख, अनुक्रम प्रतिनिधित्व में अपनी सीमित किस्म के कारण के बीच डीएनए अनुक्रम में किसी भी बेमेल कब्जा कर सकते हैं, ठीक से पता लगाने में असमर्थ है alloantibodies के खिलाफ विशेष रूप से दाता एचएलए बेमेल है. हम एक अलग तकनीक का पता लगाने और विरोधी एक व्यक्तिगत आधार पर दाता एचएलए एंटीबॉडी विशेषताएं का उपयोग कर एक पूरक विधि विकसित करने की मांग की । स्क्रीनिंग उपकरण दाता एचएलए की एक कस्टम पेप्टाइड सरणी है-एंटीबॉडी-मध्यस्थता अस्वीकृति के लिए जोखिम का आकलन करने के लिए अंग प्राप्तकर्ता के बाद प्रत्यारोपण सीरा की जांच के लिए अनुक्रम व्युत्पंन । एक दाता-प्राप्तकर्ता जोड़ी के लिए एक सरणी पर, अप करने के लिए ६०० अद्वितीय पेप्टाइड्स दाता एचएलए प्रोटीन दृश्यों के आधार पर किया जाता है, प्रत्येक पेप्टाइड एक 15-अमीनो एसिड अनुक्रम में एक बेमेल अवशेषों को ले जाने । हमारे पायलट प्रयोगों में पूर्व के लिए प्रतिजन पैटर्न की तुलना और बाद प्रत्यारोपण सीरा इन arrays पर, हम संकल्प है कि हम भी प्रतिरक्षा epitopes शामिल तुच्छ करने की अनुमति के साथ विरोधी एचएलए संकेतों का पता लगाने में सक्षम थे । ये निजीकृत प्रतिजन arrays दाता की उच्च संकल्प का पता लगाने-विशिष्ट एचएलए epitopes अंग प्रत्यारोपण में अनुमति देते हैं ।
Introduction
अंग प्रतिस्थापन चिकित्सा कि नियमित रूप से दुनिया भर में आयोजित किया जाता है जीवन के लाखों लोगों को बचाया है । ठोस अंग प्रत्यारोपण संयुक्त राज्य अमेरिका में प्रति लाख लोगों को प्रतिवर्ष लगभग १०० रोगियों में होता है, जबकि एक अधिक से अधिक संख्या अभी भी waitlists पर है दाता आपूर्ति की एक गंभीर कमी के कारण अंगों प्राप्त करने के लिए (अंग द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी के अनुसार अधिप्राप्ति और प्रत्यारोपण नेटवर्क-OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov) । अंग प्रत्यारोपण अत्यधिक आदेश में अंग अपशिष्ट को कम करने और जीवन को बचाने के लिए विनियमित है, लेकिन वैज्ञानिक उपकरण इन विनियमों को सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रभावशीलता में सीमित हैं. उदाहरण के लिए, वैज्ञानिक समुदाय पूरी तरह से उच्च संकल्प टाइपिंग और अनुक्रम आधारित टाइपिंग (SBT) का उपयोग कर डीएनए के एचएलए अणुओं और सटीक आनुवंशिक परीक्षणों के उच्च बहुरूपी राज्यों को पहचानता है हाल के वर्षों में विकसित किया गया है1, 2. हालांकि, alloantibody परीक्षण विधियों अभी तक प्रतिजन जांच के रूप में व्यक्तिगत एचएलए दृश्यों की विशाल विविधता का उत्पादन करने में सक्षम नहीं किया गया है । मानक परीक्षण आजकल के एक चर पैनल का उपयोग करता है ~ १०० allelic एंटीजन कि एचएलए के आम वेरिएंट के शामिल कर रहे हैं, मानव आबादियों में ए, बी, सी, डीक्यू, डीपी और डॉ जुगाड़3,4,5,6. अक्सर, वास्तविक है दाता एचएलए अनुक्रम परीक्षण पैनल में शामिल नहीं हैं, प्रत्यारोपण चिकित्सकों और सर्जनों को दाता के वास्तविक दृश्यों और इसी “मानकों” के बीच साझा समानता के आधार पर रक्तदाता अनुमान करने के लिए बाध्य परीक्षण सेट7,8. नतीजतन, यह कभी एंटीबॉडी परीक्षा परिणाम9,10,11,12के आधार पर अस्वीकृति जोखिम का एक विश्वसनीय अनुमान बनाने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसलिए, alloantibodies के लिए नए व्यक्तिगत रूप से अनुकूलन परीक्षण तत्काल13,14की जरूरत है ।
एचएलए जीन प्रमुख histocompatibility परिसर (MHC) रिसेप्टर्स कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण समारोह है6सांकेतिक शब्दों में बदलना । एचएलए जीन को मानव जीनोम६का सबसे बहुरूपी जीन माना जाता है. एचएलए जीन के लिए डीएनए अनुक्रमण रणनीतियों में तेजी से प्रगति के कारण, नए allelic वेरिएंट (या बस के रूप में alleles के लिए भेजा) एक विस्फोटक दर15,16में खोजा जा रहा है । २०१७ मार्च तक, १६,७५५ सत्यापित alleles IMGT/एचएलए डाटाबेस (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), जिनमें से १२,३५१ वर्ग मैं और ४,४०४ वर्ग के थे द्वितीय समूह के थे जमा किए गए थे । इसके विपरीत में, केवल एक छोटे से अधिक १०० अलग alleles मानक एकल प्रतिजन मोती (सब) परख है, जो नियमित रूप से अंग प्रत्यारोपण में alloantibodies का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । सब विधि एक Luminex प्रवाह cytometry का उपयोग कर मंच पर बनाया गया है । चूंकि परख एंटीजन के एक चर सेट का उपयोग करता है, के अलावा मामूली बैच के उत्पादन में variabilities बैच के लिए, आनटिसम परीक्षण मजबूती से व्यक्तियों में मानकीकृत किया जा सकता है और प्रयोगशालाओं में5भर । हालांकि, इस परीक्षण के लिए दाता alleles के खिलाफ विशेष रूप से विकसित सभी alloantibodies पर कब्जा करने में असमर्थ है, विशेष रूप से जब दाता अनुक्रम सब सेट से अनुपस्थित हैं । हालांकि सही दृश्यों के आधार पर दानदाताओं के प्रतिजनों का कस्टम उत्पादन वांछनीय है, वहां आवश्यक उत्पादन और परीक्षण प्रक्रियाओं को सरल बनाने में तकनीकी चुनौतियों रहते हैं ।
हमने हाल ही में गुर्दे प्रत्यारोपण के एक व्यवहार्यता अध्ययन में एक वैकल्पिक पद्धति17विषयों का वर्णन किया । विधि पेप्टाइड एंटीजन एक सरणी स्वरूप में पहले की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया और व्यक्तिगत विषयों के बाद प्रत्यारोपण सीरा । प्रत्येक सरणी कस्टम स्थान संश्लेषण विधि18,19,20,21,22,23 कि पेप्टाइड एंटीजन का उत्पादन का उपयोग कर बनाया गया था, प्रत्येक 15 लंबाई में अमीनो एसिड, पूरी तरह से संबंधित अंग दाता ए, बी, सी, DQA1, DQB1 और DRB1 के एचएलए alleles पर आधारित है । स्पॉट संश्लेषण मानक Fmoc-रसायन विज्ञान22 का उपयोग कर एक फाइबर झिल्ली पर संचालित है और एक पूरी तरह से स्वचालित रोबोट प्रणाली19,21के साथ समानांतर में कस्टम पेप्टाइड के सैकड़ों का उत्पादन कर सकते हैं । झिल्ली सरणी अलग करना और फिर से जांच चक्र के कई दौर झेलने कर सकते हैं । हमारे पूर्वव्यापी अध्ययन17में, हम एक समय श्रृंखला में एकत्र antisera के साथ प्रतिजन पैटर्न में परिवर्तन का पता लगाया (यानी, पहले और प्रत्यारोपण के बाद) । साथ ही हम सरणी डिजाइन, विनिर्माण, आनटिसम जांच और परिणाम विश्लेषण सहित कार्यप्रवाह के लिए तकनीकी प्रोटोकॉल का वर्णन । विधि प्रत्यारोपण दाताओं ‘ एचएलए अणुओं पर विशिष्ट रैखिक epitopes के खिलाफ alloantibodies का पता लगाने के लिए करना है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित स्थान सरणी के डिजाइन एक अंग है दाता एचएलए एंटीजन के खिलाफ प्रत्यारोपण में alloantibody विशिष्टता के प्रायोगिक अध्ययन के लिए है । मौजूदा सब परख मोटे तौर पर क्लिनिक में इस्तेमाल के विपरीत, प्रतिजन स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । शॉन ली और कनाडा में पश्चिमी विश्वविद्यालय के Xing li स्थान सरणी उत्पादन के साथ अपनी तरह की सहायता के लिए । हम Histocompatibility कोर पर और नमूना सेवाएं प्रदान करने के लिए पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय के व्यापक प्रत्यारोपण केंद्र में स्टाफ के सदस्यों के लिए आभारी हैं । यह काम आंशिक रूप से पश्चिमोत्तर मेमोरियल अस्पताल के सहायक बोर्ड द्वारा समर्थित किया गया है, और एक संकाय स्टार्टअप जे को पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की निधि से ।
Materials
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
Riferimenti
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD–the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
- Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients – Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great?. Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
- Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
- Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
- Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
- Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
- Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation–Worth the Risk?. N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
- Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
- Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem?. Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
- Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about?. Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
- Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
- Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing – getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
- Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
- Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
- Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
- Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
- Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
- Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).
- Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
- Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
- Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).
- Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
- Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).
