Personlig peptid matriser för detektion av HLA alloantikroppar vid organtransplantation
Summary
Avvikelser i humant leukocyt antigen (HLA) sekvenser mellan organdonator och mottagarens par är den största orsaken för antikroppsmedierad avstötning vid organtransplantation. Här presenterar vi användningen av anpassade antigen matriser som baseras på individuella givarnas HLA sekvenser sond mot givaren HLA alloantikroppar i organ mottagaren.
Abstract
Vid organtransplantation beroende funktion och livslängd av graften kritiskt av framgången för kontroll av immunologisk avstötning reaktivitet mot humant leukocyt antigen (HLA). Histocompatibility riktlinjerna baseras på laboratorietester av anti-HLA immunitet, som presenterar antingen som befintlig eller de novo genereras HLA antikroppar som utgör en större transplantation barriär. Nuvarande tester är byggda på en singel-antigen pärlor (SAB) plattform med en fast uppsättning ~ 100 förvalda rekombinant HLA antigener sond transplantation sera. Hos människor finns det dock en mycket större mängd HLA-typer, med inga två individer än identiska tvillingar som kan dela samma kombination av HLA sekvenser. Även avancerad teknik för HLA-typning och sekvensering kan just fånga eventuella skillnader i DNA-sekvensen mellan en givarens och mottagarens HLA, SAB analysen, på grund av dess begränsade utbud i sekvens representation, är inte exakt upptäcka alloantikroppar mot just de givaren felmatchade HLA. Vi försökt att utveckla en kompletterande metod som använder en annan teknik att upptäcka och karaktärisera anti givare HLA antikroppar på personlig grund. Verktyget screening är en anpassad peptid rad givare HLA-derived sekvenser för avsökning efter transplantation sera hos organ mottagaren att bedöma risken för antikroppsmedierad avstötning. På en matris för en givare-mottagare par, görs upp till 600 unika peptider baserat på givarens HLA proteinsekvenser, varje peptid som medför minst en omaka rester i en 15-amino acid sekvens. I vår pilot experiment att jämföra antigen mönster för före och efter transplantation sera på dessa matriser, kunde vi upptäcka anti-HLA signaler med den resolution som också tillät oss att lokalisera den immun epitoper som är inblandade. Dessa personliga antigen matriser tillåter högupplösta detektering av givare-specifika HLA epitoper vid organtransplantation.
Introduction
Orgel substitutionsterapi som utförs rutinmässigt över hela världen har räddat miljontals liv. Solida organtransplantationer sker i cirka 100 patienter per miljon invånare i USA årligen, medan ett större antal är fortfarande på väntelistor ta emot donerade organ på grund av svår brist (enligt uppgifter från orgeln Upphandling och Transplantation nätverk – OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Organtransplantation är hårt reglerad för att minska orgel avfall och rädda liv, men de vetenskapliga verktyg som används för att informera dessa förordningar är begränsade i effektivitet. Exempelvis det vetenskapliga samfundet erkänner fullt starkt polymorfa påstår av HLA-molekyler och exakt genetiska tester av DNA använder högupplösta maskinskrivning och sekvens-baserade skriva (SBT) har utvecklats på senare år1, 2. dock alloantikropp testmetoder har ännu inte kunnat producera en stor mängd enskilda HLA sekvenser som antigen sonder. Standardtestet numera använder en oföränderlig panel ~ 100 alleliska antigener som består av vanliga varianter av HLA, A, B, C, DQ, DP och DR sekvenser i mänskliga populationer3,4,5,6. Faktiska givarens HLA sekvenser ingår ofta inte testet på panelen tvingar transplantation läkare och kirurger för att härleda givare-specifika reaktivitet baserat på delade likheter mellan donatorns faktiska sekvenser och motsvarande ”standarder” i den testa set7,8. Följaktligen är det ibland svårt att göra en tillförlitlig uppskattning av avvisande riskbaserad antikropp test resultat9,10,11,12. Nya personligen anpassningsbara tester för alloantikroppar är därför brådskande13,14.
De HLA-generna kodar de stora histocompatibility komplexa (MHC)-receptorer som har en nyckelfunktion i immunsvar6. HLA-gener är kända för att vara de mest polymorfa generna av det mänskliga genom6. På grund av de snabba framstegen inom DNA sekvensering strategier för HLA generna, nya alleliska varianter (eller helt enkelt kallas alleler) upptäcks på en explosiv hastighet15,16. Av mars 2017, 16,755 validerade alleler hade deponerats i IMGT/HLA-databasen (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), av vilka 12 351 var av klass jag och 4.404 var av klass II grupper. I skarp kontrast representeras bara lite över 100 olika alleler i standard single-antigen pärlor (SAB) analysen, som rutinmässigt används för att upptäcka alloantikroppar vid organtransplantation. SAB metoden bygger på en Luminex plattform med hjälp av flödescytometri. Eftersom analysen använder en oföränderlig uppsättning antigener, bortsett från smärre tillverkningssatserna variabilitet i produktionen, kan testet antiserum vara standardiserade kraftfullt mellan individer och mellan laboratorier5. Detta test är dock inte att fånga alla alloantikroppar utvecklat specifikt mot de givaren allelerna, särskilt när givaren sekvenser är frånvarande från SAB set. Även egen produktion av givarnas antigener baserad på sann sekvenser är önskvärt, återstår det tekniska utmaningar i effektivisering nödvändiga produktionen och testförfaranden.
Vi har nyligen beskrivit en alternativ metod i en genomförbarhetsstudie av njurtransplanterade patienter17. Metoden används peptid antigener i formatet array för avsökning före och efter transplantation sera hos enskilda försökspersoner. Varje matris var specialbyggda använder fläck syntes metod18,19,20,21,22,23 som producerar peptid antigener, varje 15 aminosyror i längd, helt baserad på respektive organ givarens HLA-alleler av A, B, C, DQA1, DQB1 och DRB1. SPOT syntes drivs på ett cellulosa membran med standard Fmoc-kemi22 och kan producera hundratals anpassade peptider parallellt med en helautomatisk robotsystem19,21. Arrayen membranet tål flera rundor av strippar och reprobing cykler. I vår retrospektiv studie17upptäckte vi ändringar i antigen mönster med lagrade transplantation antisera samlas i en tidsserie (dvs. före och efter transplantation). Häri beskriver vi det tekniska protokollet för arbetsflödet inklusive array design, tillverkning, antiserum sondering och resultatet analys. Metoden är avsedd för påvisande av alloantikroppar mot specifika linjär epitoper på transplantation givarnas HLA-molekyler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utformningen av matrisen plats som beskrivs här är för experimentell studie av alloantikropp specificitet vid transplantation mot organdonators HLA antigener. I motsats till den befintliga SAB-analysen i stort sett används i kliniken, har antigen array metoden en stor fördel i sin flexibla design som rymmer de Sant HLA sekvenserna av enskilda givare. Den nya plattformen utnyttjar potentialen av de snabbt framryckande DNA sekvensering teknik som snart kommer att kunna producera korrekta HLA alleliska sekvens avläsni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Drs. Shawn Li och Xing Li of Western University i Kanada för deras hjälp med SPOT array produktion. Vi är tacksamma att anställda på Histocompatibility kärnan och på det omfattande Transplant Center av Northwestern universitetet för att tillhandahålla urval tjänster. Detta arbete har stötts delvis genom den extra styrelse av Northwestern Memorial Hospital och en fakultet start fond från Northwestern University till J.J..
Materials
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
Riferimenti
- Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
- Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD–the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
- Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
- Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients – Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great?. Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
- Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
- Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
- Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
- Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
- Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation–Worth the Risk?. N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).
- Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
- Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
- Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem?. Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
- Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about?. Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
- Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
- Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing – getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
- Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
- Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
- Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
- McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
- Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
- Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
- Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
- Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).
- Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
- Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
- Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).
- Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396 (2016).
- Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).
