Amyloid aflejring er kendetegnende for forskellige sygdomme og hjemsøger mange forskellige organer. Dette papir beskriver anvendelsen af selvlysende konjugeret oligothiophene fluorescens farvning i kombination med Fluorescens mikroskopi-teknikker. Denne farvning metode repræsenterer et kraftfuldt værktøj til afsløring og efterforskning af protein aggregater i både klinisk og videnskabelig opsætninger.
Proteiner, der indbetaler som amyloid i væv i hele kroppen kan være årsag eller konsekvens af en lang række sygdomme. Blandt disse finder vi neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers og Parkinsons sygdom plager primært centralnervesystemet og Systemisk amyloidose hvor serum amyloid A, transthyretin og IgG Lyskæder depositum som amyloid i leveren, karpaltunnel tunnel, milt, nyre, hjerte og andre perifere væv. Amyloid har været kendt og undersøgt for mere end et århundrede, ofte ved hjælp af amyloid specifikke farvestoffer såsom Congo rød og Thioflavin T (ThT) eller Thioflavin (ThS). I dette papir præsenterer vi heptamer-formyl thiophen eddikesyre (hFTAA) som et eksempel på nyligt udviklede supplering af disse farvestoffer kaldet selvlysende konjugeret oligothiophenes (LCOs). hFTAA er nem at bruge og er kompatibel med co farvning i immunofluorescens eller andre cellulære markører. Omfattende forskning har vist, at hFTAA registrerer en bredere vifte af sygdom forbundet protein aggregater end konventionelle amyloid farvestoffer. Derudover kan hFTAA også anvendes for optisk tildeling af forskellige aggregerede morphotypes at tillade undersøgelser af amyloid fibril polymorfi. Mens den anvendte billedbehandling metode er valgfri, vi her vise hyperspectral imaging (HIS), laser scanning Konfokal mikroskopi og fluorescens levetid imaging (FLIM). Disse eksempler viser nogle af de billeddannende teknikker hvor LCOs kan bruges som værktøjer til at opnå mere detaljeret viden om dannelse og strukturelle egenskaber af amyloids. En vigtig begrænsning til teknik er for alle konventionelle Optisk mikroskopi-teknikker, kravet om mikroskopisk størrelse af aggregater til at tillade registrering. Endvidere bør samlet omfatte en gentagne β-plade struktur til at tillade hFTAA bindende. Overdrevne fiksering og/eller epitop eksponering, der ændrer den samlede struktur eller kropsbygning kan gøre fattige hFTAA binding og dermed udgøre begrænsninger til præcis billedbehandling.
Deposition af amyloid i væv er en patologisk adelsmærke i et antal sygdomme såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, systemisk amyloidose og prionsygdomme. Trods forekomsten af amyloid-relaterede sygdomme, og det faktum, at tæt på 40 forskellige proteiner til dato har været klassificeret som amyloid prækursorer i menneskelige1, er lidt kendt om forholdet mellem amyloid aflejring og sygdom fænotype. Histologi prøver fra menneskelige patienter har været brugt både til diagnostiske og videnskabelige formål. Et stort antal dyremodeller har været etableret til at undersøge sammenhængen mellem amyloid byrde og adfærd, levetid og en række andre fænotypiske Læs outs sygdom progression2,3. Stor indsats laves også i drug discovery og design i kampen mod nogle af vores mest frygtede udbredte sygdomme. Men evalueringen af forbindelsen mellem genotype, fænotype, amyloid plaque belastning og drug administration er ikke ligetil. Værktøjer til farvning og imaging af amyloid i væv er ofte stumpt og give lav opløsning oplysninger om amyloid dannelse og struktur.
Congo rød dobbeltbrydning, ThT og ThS Fluorescens er eksempler på klassiske metoder til at opdage og analysere amyloid byrde i vævsprøver fra patient biopsier og post mortem prøver og sygdom4-dyremodeller. Disse teknikker har været brugt til flere årtier (Congo rød siden 1920erne og ThT og derivater siden i 1960 ‘ erne), og selvom instrumenteringen er blevet forfinet og giver mulighed for detaljeret analyse, farvning procedurer og analyse er stadig udføres på samme måde som næsten et århundrede siden.
I dette papir beskriver vi udnyttelsen af et stærkt følsomme roman amyloid farvestof, hFTAA5, der giver mulighed for påvisning af små umodne protein aflejringer med høj nøjagtighed, samt påvisning af modne amyloid. Sammenlignet med konventionelle farvestoffer, har hFTAA bevist at opdage en bredere vifte af sygdommen forbundet protein aggregater5,6,7. Derudover kan hFTAA også anvendes for optisk tildeling af forskellige aggregerede morphotypes8. Heri, beskriver vi hFTAA farvning og analyse af væv fra etablerede dyremodeller prion sygdom og Amyloid-β forløber Protein (APP) Transgene mus designet til at efterligne plaque udvikling i Alzheimers sygdom9,10 . Vi viser også analyse af diagnostiske og post mortem prøver fra patienter med systemisk amyloidose. LCOs har iboende egenskaber, der gør det muligt for dem at aflægge rapport om konformationelle forskelle inden for én plaque; og ved at kombinere to LCOs med forskellige egenskaber med hensyn til bindende og fluorescens, forskellen er endnu mere udtalt11. Et epifluorescensmikroskop udstyret med lang pass-filtre og en hyperspectral kamerahoved bruges til at muliggøre objektive klassificering af spektrale egenskaber og optagelse af micrographs for spektralanalyse. Konfokal Fluorescens mikroskopi med en afstemmelige laser som magnetisering kilde bruges til at evaluere de tredimensionale egenskaber af en amyloid plaque i større detalje. Afstemmelige laser giver mulighed for samling af excitation spektrum og en trin mindre udvalg af emission bølgelængder på mikroskopet kan Co billeddannelse af LCO fluorescens og immunfluorescens at bestemme Co lokalisering af target protein og amyloid. FLIM tilbyder hidtil uset følsomhed over for konformationel forskelle pålagt LCOs og afslører forskelle, der ikke kan registreres på fluorescens emission spektre.
De overordnede mål med metoden beskrevet farvning er at lette følsomme påvisning af små amyloid aflejringer og karakterisere konformationelle polymorfi inden for amyloid aflejringer. Denne viden er vigtig for den grundlæggende forståelse af protein sammenlægning sygdomme.
Deposition af anderledes foldede proteiner i amyloid er en vigtig begivenhed for mange sygdomsprocesser. Ekstracellulære, amyloid plaques består af Aβ peptider og intracellulære neurofibrillary tangles dannet af hyperphosphorylated tau findes i hjernen hos patienter med Alzheimers sygdom. En række forskellige proteiner, fx, transthyretin (TTR), Serum Amyloid A komponent (SAA), og IgG lys kæde misfold og manifestere sig som amyloid aflejringer i væv uden for CNS. Selvom amyloid aflejringer har været kendt og undersøgt for mere end et århundrede, vi stadig mangler detaljeret viden om hvordan amyloid er aflejring indledt på det molekylære niveau, og hvad kan gøres for at forhindre denne proces. For Alzheimers sygdom er det nødvendigt at bekræfte, hvordan processen med amyloidose er forbundet med neurodegeneration. Én nøgle søgen på missionen at behandle amyloidose er at udvikle roman finjusteret værktøjer til overvågning af amyloid indledning, progression og regression; Derfor er målrettet amyloid opdagelse nøglen. I det lange løb klinisk diagnostik vil drage fordel af øget følsomhed og selektivitet af amyloid farvning metoder7,15. Aktuelle udfordringer i denne henseende er enorm og er en meget aktiv forskningsområde. Én vigtigste spørgsmål for klinisk udvikling og forsøg er prognostiske diagnose. Disse sygdomme, som kan starte godt før symptomer vises, men til at begynde med behandling der skal være identifikation af sygdommen. Heri, er følsomhed et centralt aspekt for nye metoder. Desuden, problemet er endnu mere komplekse, fordi nogle protein aggregater er giftige, nogle er beskyttende, og nogle er neutral. Dermed er evnen til at overvåge specifikke aggregerede morphotypes væsentligt da eksistensen af forskellige aggregerede arter er blevet foreslået til at forklare heterogene fænotype rapporterede for en mangfoldighed af neurodegenerative protein sammenlægning sygdomme. For eksempel, er prionprotein et klassisk eksempel på hvordan en identiske primære sekvens af aminosyrer kan misfold i forskellige samlede morphotypes, som giver anledning til særlige prion stammer. Lignende polymorfi er også blevet rapporteret til Aβ-peptid, α-synuclein og tau. I denne henseende har LCOs vist sig at være fremragende værktøjer til optisk tildeling af forskellige aggregerede morphotypes. Prion-stamme-specifikke protein aggregater, protein indskud findes i flere typer af systemiske amyloidose, samt polymorfe Aβ og tau aggregater har været kendetegnet på grund af den for induceret optisk fænomen observeret fra LCOs.
Amyloid aflejring er en begivenhed, der finder sted i væv, der er svært at trænge igennem med biokemiske eller biofysiske metoder i molekylær præcision. Muligheden for at sonde begivenheder ex vivo, i vivoog in vitro- ved hjælp af de samme LCO molekyler sætter scenen for unraveling hændelser, som forekommer i vivo ved hjælp af teknikker, der er kun muligt at anvende på ex vivo eller i vitro prøver11,17. En nylig rapporteret høj opløsning strukturelle model viser at LCO pentameric FTAA (pFTAA) bindes i et hulrum dannet af justeret sidekæder parallelt med fibril akse der strækker sig over 6 i registret parallelle beta-tråde18, viser, at det er muligt at få atomic opløsning viden om enheder af LCO mål. Bindende hulrum og bindende tilstand af pFTAA er i virkeligheden svarer til Congo rød19, dikteret af et groove, foret med gentagne positivt ladede Lys side-kæder. Affinitet af LCOs synes at være bedre i forhold til Congo rød sandsynligvis kæde fleksibilitet og stærk van der Waals interaktioner af svovl atomer Ringenes thiophen mod den hydrofobe hulrum. Påvisning af prefibrillar arter (før ThT reagerer)5,20 vises afhængig af gentagne β plader, sammensat af i registrere parallel-beta-tråde, der for hFTAA er to thiophen enheder længere end pFTAA ville span passage af op til 8 beta-tråde.
Farvning protokollen kræver opmærksomhed til fejlsøgning på følgende: (i) fiksering: omfattende fiksering af vævsprøver kan forstyrre den amyloid struktur og begrænse muligheden for at opdage variation i fluorescens-spektre induceret af konformationelle forvrængning af hFTAA-molekyle. Mild fiksering af snit frosset organmateriale fra frisk frosset materiale er foretrukket at opnå optimal spektrale opløsning. Men hFTAA vil plette og fluorescerer amyloid i faste væv, men med reduceret effektivitet og mindre spektrale variation. (ii) epitop eksponering: forbehandling af væv at nå epitop eksponering for antistof bindende kan undertiden reducere evnen til hFTAA til at binde på grund af forstyrret amyloid struktur. Hvis dette er et problem, og epitop eksponering er et afgørende skridt i antistof farvning protokol, ved hjælp af på hinanden følgende sektioner for antistof og hFTAA, kan henholdsvis betragtes. (iii) overstaining: hFTAA er ekstremt følsomme. Arbejde løsninger bør opbevares ved lav nM koncentration. Mindske koncentrationen af hFTAA, hvis baggrund farvning er et problem. Hvis elementer, der binder hFTAA er sparsomme i væv, kan et overskud af hFTAA samlede og ophobes i montering medium. Dette er anerkendt som fluorescens, der ikke er i fokus flyet af væv sig selv. Hvis dette forekommer, fordybe Den monterede dias i PBS indtil cover slip kan være gled af afsnittet, vask med PBS, og monter med friske montering medium og et nyt cover slip. (iv) filter baseret billedbehandling: dette papir beskriver det meste spektralt løst fluorescens imaging bruger lang pass-filtre eller flere opdagelse kanaler. hFTAA kan også blive overvåget ved hjælp af korte pass-filtre. Vær opmærksom på at dette vil reducere kontrasten og afskaffe muligheden for at opdage flere farver.
I de seneste år er det blevet klart, at forskning værktøjer, fluorescerende LCOs og især hFTAA viser meget lovende egenskaber. Resultater har været demonstreret for et stort udvalg af proteiner og sygdomstilstande, lige fra hFTAA påvisning af aggregater inde celler (tau, inklusion krop myositis), systemisk amyloid serum amyloid A, transthyretin, Immunoglobulin lys kæder (kappa og Lambda) seminogelin 1, prion protein (herunder kliniske prøver)21, Holmen amyloid polypeptid og insulin7,15. En begrænsende faktor for gennemførelsen af hFTAA som et diagnostisk redskab er, at Fluorescens mikroskopi ikke er flittigt brugt i rutinemæssige amyloid patologi labs. Endvidere, hans er ikke let tilgængelige i klinikken. Men hFTAA amyloid farvning og Fluorescens mikroskopi er blevet brugt i kliniske laboratorier i et filter baseret fluorescens mikroskop og børbetragtes som en gratis diagnostisk metode. Dette blev for nylig demonstreret på karpaltunnel biopsier med transthyretin amyloidose ved hjælp af grundlæggende indstillinger for fluorescens i en automatiseret måde22.
Endvidere ud over forskellige proteiner, hFTAA fluorescens genkender en lang række fibril typer og pre fibrillar amyloid aggregater, fx, pathway fibrillar arter er blevet opdaget og karakteriseret. I denne publikation har vi påvist én LCO på forskellige prøve typer ved hjælp af tre mikroskopi-teknikker. Brugen af kontrollerede syntese har også tilladt for udviklingen af LCOs for alsidig påvisning af Biomolekylær mål, f.eks.registrering af interaktioner af overflade plasmon resonans (SPR)23 og radiolabeling for positron emission tomografi (PET)24.
Til dato har er over 25 forskellige LCOs med blevet offentliggjort. Øget brug af LCOs til billeddannelse af amyloid aflejringer vil øge viden og forståelse af, hvordan disse sygdom-associerede aggregater samle, demontere og blande sig med de organer og personer, hvor de er bosat.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Mikael Lindgren og Chanan Sluzny for rådgivning på Fluorescens mikroskopi, og Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias sporskifteomstillingudbydere, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark og Kurt Zatloukal for at bidrage væv sektioner eller micrographs vises i denne publikation. Indsamling af præsenteres data heri har været finansieret af bidrag fra svenske hjernen Foundation (Hjärnfonden), den svenske Alzheimers association (Alzheimerfonden), det svenske Forskningsråd (VR), foreningen Göran Gustafsson Georg & Astrid Olsson, EU RP7 sundhed projekt LUPAS og Linköping Universitet.
hFTAA/Amytracker545 | Ebba Biotech | ||
Dako fluorescene mounting medium | Agilent technologies | GM304 | |
LeicaDM6000 | Leica | ||
Lumen 200 | Prior | ||
Spectraview system | ASI spectral imaging | ||
Spectraview software | ASI spectral imaging | ||
LSM780 | Zeiss | ||
Zen 2010b v6.0 software | Zeiss | ||
FLIM system | Becker & Hickl | ||
Ar/ML 458/488/514 | Zeiss | ||
Tunable Laser In Tune | Zeiss |