현재 프로토콜 있는 사용자가 자기 공명 현미경 데이터의 수집 하는 동안 급성 hippocampal 및 대뇌 피 질의 조각 준비의 유지할 수 있는 방법을 설명 합니다.
이 프로토콜의 자기 공명 (MR) 현미경 데이터 수집 중 급성 뇌 슬라이스 준비의 정상적인 신진 대사 기능을 지 원하는 데 필요한 절차를 설명 합니다. 생활, 삭제 포유류 조직에 씨 컬렉션을 수행할 수 있지만, 이러한 실험 해상도 제한에 의해 제한 된 전통적으로 있다 하 고 따라서 조직 미세를 시각화 할 수 있다. 반대로, 미세한 이미지 해상도 달성 한 미스터 프로토콜 긴 검사 시간 동안 정적, 변하지 않는 조건에 대 한 필요성에 맞게 고정된 샘플의 사용을 해야 합니다. 현재 프로토콜 미세한 해상도에서 생활, 포유류 조직 샘플의 이미지를 가능 하 게 첫 번째 사용 가능한 미스터 기법을 설명 합니다. 이러한 데이터는 어떻게 병 리 기반 대비 변화 미세한 수준 영향에서 발생 병원에서 사용 하는 등 거시적인 미스터 검사의 내용 이해에 매우 중요. 일단 이러한 이해, 더 큰 감도 정확도와 진단 방법을 개발할 수 있습니다, 이전 질병 치료, 더 정확한 치료 모니터링 및 향상 된 환자 결과를 직접 번역할 수 있는 실현 된다.
설명된 방법론 뇌 조각 준비에 초점을 맞추고, 하는 동안 프로토콜은 어떤 삭제 조직 조각에 주어진 조직의 대사 요구에 맞게 가스 perfusate 준비 변경. 프로토콜의 성공적인 실행 15.5 h까지 동안 미스터 확산 신호 안정성을 전시 하는 생활, 급성 슬라이스 준비 발생 한다. 다른 미스터 호환 관류 기구에는 현재 시스템의 주요 장점은 높은 해상도 이미지와 신중 하 게와 일정, 중단 흐름을 제공 하는 능력을 달성 하는 데 필요한 미스터 현미경 하드웨어와의 호환성 규제 perfusate 조건입니다. 하나의 조직 조각을 한 번에 몇 군데 있습니다 감소 샘플 처리량이 설계 고려 사항입니다.
자기 공명 영상 (MRI) 시스템 꾸준히 진행 하 고 있으므로 적 높은 분야 강점, 구성 및 조직 생활의 상태에 대 한 자세한 내용은 뚜렷한 되고있다. 이러한 하드웨어 발전에도 불구 하 고 직물의 세포질 구조를 시각화 하는 충분 한 해상도에서 이미징 미스터 병원에서 아직 사용할 수 없습니다입니다. 그 결과, 임상 검사의 내용을 고려할 때 조직의 세포 수준 특성을 유추 해야 합니다. 이러한 유추는 직접 관찰 될 수 있는 모델 시스템에서 가져온 데이터에서 얻은 동등한 프로세스의 지식이 필요 합니다. 전통적으로,이 모델 Xenopus laevis oocyte Aplysia californica L7 신경1,2등 수생 생물에서 세포 포함. 이들은 관찰 미스터 방법 그들의 예외적인 큰 크기 때문에 사용할 수 있는 첫 번째 동물 세포 중: 약 1000 μ m 및 300 μ m 직경, 각각. 더 최근에, 하드웨어 디자인에 진보 포유류 세포의 가장 큰 예제 중 하나에 대 한 허용-α-모터 신경-고정된 조직3,4미스터 현미경 검사 법 기술을 사용 하 여 이미지 수를. 이러한 연구 시연 씨를 사용 하 여 포유류 세포 물질의 직접적인 시각화, 고정된 샘플 고용 살아있는 조직에서 그들의 미스터 속성에 크게 차이가 고 동등한 대표 모델5, 따라서 역할 수 없습니다. 6. 더 중요 한 것은, 복잡 한 생물 학적 과정을 콘서트에서 발생 하는 미스터 대비 변화 관찰 불안정 하 고 이미징 실험의 과정을 통해 측정 될 수 있는 생활 샘플을 필요 합니다.
생활 조직에 미스터 현미경 연구를 촉진 하기 위하여 프로토콜 상업 microimaging 하드웨어7 하는 목적, 미스터 호환, 구멍에서 oxygenator 관류 장치 앞에서 설명한8 인터페이스를 포함 하 여은 . 이 디자인의 독특한 장점을 포유류 조직 및 녹은 가스 콘텐츠 및 조직 관류의 사이트에서 pH 정밀 제어에 세포 수준의 해상도 기능을 포함합니다. 또한, 관류 흐름 유물을 피하기 위해 이미지 수집 동안 인터럽트는 explant 미스터 연구의 대부분과 달리이 디자인의 생리 적인 상태를 개선 하기 위해 표시 되었습니다 데이터 수집 하는 동안 지속적인 관류를 사용 하 여 지원 절연 조직9,10. 마지막으로, 모션 아티팩트는 동안 발생할 수 있는 가능성을 줄이는 닫힌된 녹음 실과 슬라이스 고정 하드웨어 원조는 이미지 컬렉션을 연장.
현재 프로토콜 급성 hippocampal 및 대뇌 피 질의 조각으로 사용 하기 위해 적절 한 절차를 설명 합니다, 하는 동안 perfusate 대사 산물 정밀 하 게 제어 다양 한 다양 한 조직 유형 및 실험 조건에 맞게이 시스템을 수 있습니다. 멀티 슬라이스 관류 챔버11; 비교 샘플 처리량에서 감소를 포함 하는이 디자인의 한계 그러나,이 제한 미래에 멀티 코일 배열을 사용 하 여 극복할 수 있습니다.
또한, 설명된 시스템 수평 또는 수직 구성에서 채택 될 수 있다, 하는 동안 현재 프로토콜 세로 방향된, 600 MHz 분석기 사용을 갖추고 있습니다. 미스터 microimaging 연구의 모든 시스템-일반적으로 좁은 구멍 (≤6 cm), 높은 분야 (≥500 m h z) 분석기-설명 oxygenator 및 살포 장비를 수용할 것입니다. 그러나, 이미징 코일, 그라데이션, 프로브 시스템 변경, 또는 다른 필수 이미징 하드웨어 고용 관류 장비와 미스터 스캔 매개 변수를 변경 해야 수 있습니다.
현재 프로토콜 자기 공명 현미경 검사를 받고 급성 뇌 슬라이스 준비의 표준 대사 유지 관리에 필요한 절차를 설명 합니다. 이 절차는 유일한 방법은 현재 사용할 수 있는 해상도에서 씨와 생활 포유류 직물의 시각화를 셀을 해결 할 수 있도록 합니다. Perfusate 조건 설명 맞게 조정 됩니다 구체적으로 중앙 신경 조직, 프로토콜 널리 어떠한 방식으로 생활의 적응력은 perfusate와 가스 성분의 관류 흐름 율 조정을 통해 조직 준비 그리고 온도입니다.
가장 일반적인 문제를 설명한 절차 중 발생할 수 가능성이 실패 대사 산물 공급에 관련 된 포함 됩니다. 칼슘 염의 강 수는 실제 내부 시스템 버퍼링 중 탄산염에서 실패의 결과로 가스 부족 하는 동안 발생할 수 있습니다. 이러한 침전 관류 라인을 방해할 하 고 심각한 하드웨어 손상 될 수 있습니다. 소금 침전 물 조사 어셈블리를 다음과 같은 perfusate에서 관찰 된다, 중단 관류 흐름 즉시 연동 펌프를 해제 하 여. 공급 가스 및 저수지와 oxygenator carbogen 가스 흐름 (1/16 L/min)에서 perfusate, CO2 수준 (5.0%)에 충분 한 나트륨 중 탄산염 수준 (4.37 g/2 L)의 존재를 확인 합니다. 마지막으로, 확인 전화 수준의 생리 범위 (7.3-7.4)에 안정 됩니다. 산소 가스와 pH 레벨은 여전히 통제 되지 적절 하 게, 가스 교환 막 대체 되어야 한다.
조각 의도 실험 시간-과정을 통해 신호 안정성을 전시 하지 않습니다, 경우 올바른 화학 성분 실제 혼합물에 존재 하 고 올바른 osmolality (300 mOsm) 및 (7.3-7.4) pH 유지 됩니다 확인 합니다. Carbogen 가스 perfusate 저수지와 oxygenator 1/16 L/분에 공급 되는 확인 하십시오. 이 단계는 perfusate 조건 해결 되지 않습니다, 가스 교환 막의 교체 조언 된다. 조직 안정성은 하지 perfusate 조건 문제 해결 후 경우, 조직 수확 및 관류 응용 프로그램 사이의 시간 간격을 최소화에 중점을 두고 수술 프로토콜의 세련미를 고려 하십시오.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강의 국가 학회 (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (S10RR031637), 그리고 국립 과학 재단 (협력 계약 번호 DMR-1157490) UF와 플로리다의 상태에 국가 높은 자기장 실험실 (NHMFL) 고급 자기 공명 분광학 (AMRIS) 시설을 통해.
Perfusate Preparation | |||
Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Slice Preparation | |||
Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Perfusion System | |||
Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MR Imaging Hardware | |||
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |