Denna teknik beskriver en effektiv screening process för att utvärdera bakterier-specifika optisk imaging agenter inom ex vivo mänsklig lungvävnad, av fibered confocal fluorescensmikroskopi för snabb identifiering av små molekyler kemiska PROBE-kandidater med översättningsbara potential.
Det är viktigt för patientens stratifiering och för att säkerställa lämplig användning av antimikrobiella medel att förbättra hastighet och precision för bakteriell upptäckt. Att uppnå detta mål, utveckling av diagnostiska tekniker att erkänna bakteriella närvaron i realtid på den point-of-care krävs. Optisk imaging för direkt identifiering av bakterier inom värden är en attraktiv metod. Flera försök på kemiska sonden design och validering har undersökts, men ingen har ännu lyckats översatts till kliniken. Här beskriver vi en metod för ex vivo validering av bakterier-specifika prober för identifiering av bakterier inom distala lungorna, fotograferad av fibered confocal fluorescensmikroskopi (FCFM). Vår modell används ex vivo mänsklig lungvävnad och en kliniskt godkänd confocal laser endomicroscopy (CLE) plattform till skärmen roman bakterier-specifika imaging föreningar, noga härma imaging villkoren förväntas uppkomma med patienter. Därför ger screening föreningar genom denna teknik förtroende potentiella kliniska tractability.
Denna teknik beskriver en snabb screening process för att utvärdera bakterier-specifika optisk imaging agenter inom ex vivo mänsklig lungvävnad av CLE med FCFM för snabb identifiering av föreningar med potentiella kliniska verktyg för att visualisera bakterier i den distala lung i situ.
Det finns ett brådskande globala krav att ransonera antimikrobiella förskrivning i eran av ökande antibiotikaresistens1. Därför sökte utveckling av diagnostiska metoder som fungerar att identifiera bakteriell infektion med hög specificitet, känslighet, och i realtid är mycket2. Nuvarande metoder för att bekräfta en diagnos av lunginflammation i kritiskt sjuk patienter, såsom de inom intensivvårdsavdelningar (IVA), är ofta beroende av tolkningen av icke-specifika kliniska eller radiologiska funktioner tillsammans med bakteriekultur tekniker från aspirerade vätskor eller vävnaderna, vilket kan ta upp till 3 dagar att producera resultat. Dessutom bakterieodling från vätska ingjutit i distala lungan och Hämtad är benägna att kontaminering från mer proximala airways3 och är ofta kultur negativt på grund av samtidig antimikrobiell terapi eller dålig urvalsmetoder. Dessutom, är molekylära tekniker såsom polymeraskedjereaktion alltför känslig när det används på aspirerade vätskor, att riskera överbehandling av patienter. Framväxande diagnostiska tillvägagångssätt är molekylära optisk imaging, att göra i situ molekylär patologi av vävnader en möjlighet; utveckling och validering av optisk imaging föreningar krävs dock. Dock direkt visualisering av bakterier, via activatable Optiska prober är potentiellt en mycket kraftfull metod för att möjliggöra studier av förekomsten och utvecklingen av lunginflammation hos patienten, och viktigast, kunde användas att studera värd-patogen interaktioner i svar på behandling i realtid jordbaserad.
CLE är en etablerad undersökande förfarande i flera sjukdomar4, inklusive inom områdena gastroenterologi5, onkologi6,7, och för sökning i luftvägarna och alveolära säckar8, 9. det möjliggör point-of-care strukturell avbildning av sjuk vävnad med hjälp av en fiber imaging bunt, som passerar genom kanalen arbeta av en klinisk endoskop och former direkt kontakt med vävnadsytan för att avbildas av konfokalmikroskopi. Dock är en begränsning som återstår behovet av generiska kontrastmedel. Användning av sjukdom särskilda sonder, såsom specifika bakterier agenter, kunde därför kraftigt utöka nyttan av denna stödform genom att direkt visualisera bakterier på platsen för misstänkt infektion. Optiska agenter erbjuder många fördelar jämfört med andra tekniker genom att möjliggöra realtid, hög upplösning imaging med diagnostiska potential. Dessutom erbjuder optisk sonder utsikterna för multiplexing för sökning i flera mål, alla uppnås till en relativt låg kostnad. Ett antal optiska agenter är under utveckling för ett sådant ändamål, men ingen har ännu genomförts framgångsrikt inom kliniken10. Vi har syntetiserat ett bibliotek av liten molekyl kemiska sonder med specificitet mot bakterier och utvecklat en snabb, effektiv rörledning för utvärdering av sonden funktion för att upptäcka bakteriell lunginflammation i situ11.
För att identifiera lämpliga sonden kandidater, hade följande krav uppfyllas innan förhör av sonden på ex vivo mänsklig lungvävnad av FCFM: i) vattenlöslighet, ii) specificitet och selektivitet för snabbt märkning kliniskt relevanta bakterier, iii) en hög signal-brus-förhållande, och iv) motståndskraft mot nedbrytning i lung-miljön. Den senare bedömdes av bronkoalveolär lavage vätska (BALF) från patienter med akut andnödssyndrom (ARDS), som är ett tillstånd som kännetecknas av proteolytiska och inflammatoriska miljöer i lungan på IVA. Dessutom hade sonderna ha en lämplig fluorophore för detektion av ett kliniskt godkänd optiska CLE bildenhet inom human alveolär lungvävnad.
Rörledningen att förhöra var och en av dessa förutsättningar var följande (i varje skede, endast sonder som passerat har överförts till nästa): (1) ett bibliotek av sonder för utredas syntetiserades; (2) varje sond lades till en panel av levande bakterier för confocal laserscanning mikroskopi (CLSM) för att säkerställa bakteriell märkning; (3) selektivitet av bakteriell märkning över däggdjursceller i samtidig kulturer med primära humana neutrofiler grundades av CLSM; (4) stabilitet och framgångsrika märkning av bakterier i närvaro av ARDS patienten BALF bestämdes av CLSM och Matrix Assisted Laser Desorption och jonisering-tid för flygning (MALDI-TOF) Mass Spectrometry; (5) optimala koncentrationen av kandidaterna var beslutsam vid CLSM, att garantera selektivitet för bakterier över däggdjursceller upprätthölls; (6) kandidater var fotograferad av FCFM i suspension och på ex vivo human alveolär lungvävnad att säkerställa stabilitet och att den signal-brus var tillräcklig för att upptäcka. Steg 6 beskrivs i detalj i detta protokoll. Metodik för steg 1-5 har varit tidigare rapporterade11.
Nedre luftvägsinfektioner står för näst högsta sjukdomsbördan globalt12,13, och en betydande ökning av antalet infektioner som tillskrivs antimikrobiella resistenta bakterier har varit rapporterade14. Lunginflammation är fortfarande en vanlig orsak till sjukhusinläggning. På IVA, utvecklingen av en lunginflammation förvärras av diagnostisk osäkerhet och är associerade med en extremt hög dödlighet klassar15. Under början av lunginflammation föröka bakterier inom alveolära distala lungan, ett område som är relativt sterilt, med minimal bakterieflora i hälsa.
Denna metod beskriver relativt sent skede ex vivo validering av bakterier-specifika optisk imaging sonder11, men design, syntes, och sonden utvärdering innan du påbörjar denna valideringsstegen är imperativ, som tidigare visat11 .
CLE är en framväxande klinisk teknik för förhör sjukdom uppger i situ i realtid. Det erbjuder många fördelar jämfört med traditionella tekniker för att utreda misstänkt pulmonell patologi, som kan innebära en biopsi och insamling av lavage vätska. Biopsier är invasiv och kan orsaka sjuklighet och dödlighet hos ventilerade patienter, och insamlade lavage vätska är ofta förorenat med bakterier från de övre luftvägarna. Användningen av CLE för detektion av lunginflammation är dock något begränsad på grund av dålig tillgång till kompatibla imaging sonder som kan tillhandahålla funktionell information av sjukdom, trots många samordnade insatser10. Kombinera CLE med optiska medel erbjuder möjligheten att diagnostisera lunginflammation snabbare och mindre jämfört invasivt med nuvarande praxis.
De kritiska steg till detta protokoll är i provberedning och inställning av CLE plattformen. Att erhålla mänsklig vävnad som är relevanta för den slutliga kliniska ansökan är också viktiga, såsom mänsklig lungvävnad som visat inom denna studie. Det är nödvändigt att använda mänsklig vävnad eftersom omfattningen av vävnad autofluorescens visar varierar kraftigt mellan arter, och kan därför vilseleda känsligheten hos bakterier-sonden som avbildas. Dessutom är det viktigt att erhålla etik för hämtning och användning av mänsklig lungvävnad. Från en teknisk nivå, rätt rengöring är fastsättning av imaging fiber till imaging LSU plattform och kalibrering viktigt för bra upplösning och konsekvent avbildning, som är att säkerställa att motsvarande antal bakterier läggs till varje lunga vävnadsprov. För att ytterligare öka nyttan av denna metod för screening paneler av sonder, är det nödvändigt att upprepa proceduren med ett utbud av patogener, såsom de sannolikt att smittämnen av lunginflammation.
Den största begränsningen av denna teknik är att kliniskt godkänd CLE enheten har endast en laser (488 nm). Därför, för närvarande, val av fluorophore för sonden design är begränsad för användning med detta system, men kliniskt godkänd enskild färg enheter finns med excitation våglängder av 660 nm och infrarött. Det är önskvärt att ha en andra laserlinje genomföras inom samma enhet till aktivera en sond utvecklas med ett spektralt distinkta fluorophore att förbättra bakterier-probe känslighet över vilken nivå av vävnad autofluorescens. Tvåfärgad CLE enheter är under utveckling, de är antingen inte är kliniskt godkända och/eller deras kostnad är betydande16.
CLE in vitro- som med patogena bakterier och ex vivo mänsklig lungvävnad till skärmen potentiella sonder överbryggar gapet mellan konventionella in vitro- metoder såsom flödescytometri och CLSM och klinisk nytta. Detta steg erbjuder förtroende när du väljer lovande föreningar att bära fram för att vara tillsammans med kliniska CLE imaging; och kommer att lämna uppgift om huruvida testade sonden upprätthåller målet specificitet, eller visar någon off-target märkning, såsom bindande direkt till vävnad, eller visar instabilitet med värd proteolytiska enzymer. Det skulle också vara relevant att lägga till var och en av de activatable sonderna direkt på prover av mänsklig lungvävnad plus bakterier, att fullständigt karakterisera hastigheten på sonden bindning och aktivering i realtid.
Vi tror att vår pipeline för snabbt screening roman bakterier-specifika prober för att bedöma deras potential för imaging inom den distala lungan av patienter kommer att resultera i mycket snabbare översättning till kliniken. Detta beror till stor del om bakterier-specifika sonden kunde levereras lokalt inom lungan genom en kateter insatt ner kanalen arbeta av en bronkoskop, vilket innebär att microdose (< 100 µg) belopp kunde levereras. Därför är systemiska leverans och biodistribution av föreningen inte en oro, som är fallet för många andra infektion mål inom kroppen, eller med Kärn avbildning. Leverera imaging sonden i en så liten dos minskar dessutom risken för toxicitet relaterade komplikationer (även om toxicitet screening skulle krävas för översättning). Efter instillation av sonden, katetern skulle sedan kunna ersättas av FCFM fiber och samma område i lungan förhördes av CLE, ungefär på samma sätt som vi har utfört inom denna metod. Imaging bör utföras snabbt efter installation av sonden innan sonden tvättar bort till omätbara koncentrationer.
Det är också viktigt att notera att screening av sjukdom-identifierande sonder genom denna teknik bör inte begränsas till bakteriell-imaging agenter, men kan också sträcka sig till validering av sonder med alternativa mål, såsom inflammation. Denna strategi bör också anpassas till andra sjukdom platser i kroppen där imaging via FCFM är tillåtet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Engineering och Physical Sciences Research Council (EPSRC, Storbritannien) tvärvetenskapligt forskningssamarbete grant EP/K03197X/1, Institutionen för hälsa och Wellcome Trust genom hälsa Innovation Challenge Fund (HICF) . Finansiering referensnummer: 0510-069.
1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |