여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한 유전자 발현 및 수명에 관련 된 프레임 워크 제시. 우리는 넓은-범위 식이 제한 및 유전자 발현이이 패러다임에서의 양적 이미징에 대 한 프로토콜 설명합니다. 우리는 더 이상 음식 감지에 관여 유전자 회로의 정보 처리 기능 기본 공개 전산 분석 개요.
감각 시스템 감지, 처리, 및 그들의 환경에 반응 하는 동물을 수 있습니다. 음식 풍부한 동물 생리학과 행동에 깊은 영향 환경 큐입니다. 최근에, 우리는 음식 풍부에 의해 선 충 류 꼬마 선 충 에서 장 수의 변조는 이전 인식 보다 더 복잡 한 것을 보였다. 음식 수준에 변화에 수명의 응답 신경 회로 내에서 처리 하는 정보를 제어 하는 특정 유전자에 의해 결정 됩니다. 우리의 프레임 워크 결합 유전자 분석, 높은 처리량 양적 이미징 및 정보 이론. 여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한과 생리 적인 관련성은 어떤 유전자의 특성 이러한 기법을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 특히,이 워크플로 어떻게 관심사의 유전자 조절 수명 넓은 범위 식이 제한;에서 공개 하도록 설계 되었습니다. 다음 설정 어떻게 유전자의 표현 따라 음식 수준; 그리고 마지막으로, 제공 하는 정보의 양의 편견된 정량화를 환경에서 음식 풍부에 대 한 유전자 발현에 의해 전달. 신경 회로의 컨텍스트에서 여러 유전자를 동시에 검사 하는 경우이 워크플로 회로 의해 고용 된 코딩 전략을 파악할 수 있습니다.
모든 유기 체는 감지 하 고 그들의 생존을 위해 환경에 변화에 대처할 수 있이 필요가 있다. 동물, 신 시스템 기본 검출기와 변환기의 환경에 대 한 정보는 고 생물의 생존1에 영향을 미칠 수 있는 모든 변화에 생리 적인 응답을 조정 합니다. 음식 풍부한은 환경 큐 여러 상황에 잘 공부 뿐만 아니라 채집2, 등 음식 관련 행동을 조절 하지만 또한 동물의 장 수에 미치는 영향입니다. 수명 변화 음식 풍부에 의해 변조 식이 제한 (DR)으로 알려진 현상 이며 광범위 한 진화 보존3.
꼬마 선 충 선 충 류는 근본적인 생물학 질문을 해결 하기 위한 강력한 모델 시스템입니다. 기술의 과다 웜 게놈 RNAi 및 vivo에서 유전자 기술 편집 등의 조작을 허용 하는 개발 되었습니다. 벌레 및 광학 투명도의 작은 물리적 크기 또한 빌려 스스로 모두 transcriptional 및 변환 형광 기자 들의 비보에 이미징 및 높은 처리량 등의 기술 마이크로4유틸리티. 함께, 이러한 도구 어떻게 신경 회로 직접 동물 행동 검사 밝혀 될 수 있습니다.
C. 선 충 은 bacterivore 이며 여러 가지 방법이 세균성 농도5,6,7,8 조작 하 여 음식 풍부의 정확한 제어를 허용 하는 게시 된 . C. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 박사 두 개의 다른 문맥에서 연구 되었습니다. 처음으로 다른 유기 체에서 음식 수준 감소에 대 한 응답에서 본 변화 거울 ‘클래식 닥터’, 불릴 수 있다. 이러한 맥락에서 음식 풍부한 광고 libitum 수준에서 감소 결과 증가 수명에 최적에 도달 하면, 후이 지점 장 수 감소 음식6,7, 더 감소 될 때까지 9. 두 번째 컨텍스트는 박사 C. 선 충 에서 공부 하고있다 어떤 세균성 음식 소스10,11의 완전 한 제거로 벌레의 장 수 증가 규정식 부족 이다. Entchev 외. (2015)12, 우리는 박사가 두 개의 다른 패러다임에서 결과에 복잡성을 시험 될 수 있다 보였다 동시에 컨텍스트에서 우리 용어 ‘넓은 범위 박사’. 아래에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 유전자의 새로운 클래스 식별 박사에는 양방향으로 음식 풍요에 수명 응답을 조절 하 고 음식12 (그림 1)을 감지 하는 신경 회로에 관련 된.
환경 변화에 동물의 응답 생리학에 환경 정보를 전달 하는 복잡 한 규제 상호 작용을 감각 시스템을 연결 하는 생물학 과정의 순서를 통합 합니다. 같은 “정보 흐름”의 기계적 세부 사항 들은 알려진 하 고, 비록 다른 생물 학적 구성 요소 들이 복잡 한 계산 구성 방법을에 대 한 통찰력을 얻으려고 유전 도구를 사용할 수 있습니다. 우리의 최근 작품에서 우리는 daf-7 , tph-1 식품 감지 신경 회로, 변조 선 충 C.12 수명 통해 음식 풍부에 대 한 환경 정보의 전송에 참여 보였다 , 13. 정보 이론14의 수학적 프레임 워크를 적용 하 여 우리 환경 정보, 비트, daf-7 와 유전자 식 변화에 의해 표현 되는 금액을 정할 수 있었다 tph-1 다른 음식 수준에서 특정 신경 세포에. 이것에서 우리 다음 (그림 2)이 신경 회로 어떻게 유전자 제어에 의해 고용 인코딩 전략을 밝히기 수 있었다.
다음 프로토콜에서 우리는 특정 신경 세포에 표현 된 관심사의 유전자의 영향 무엇 이며 어떻게 그들이 수명 환경에서 음식 정보 흐름에 참여를 이해 하는 데 필요한 단계를 개요. 광범위 하 게, 우리는 분리 두 실험 프로토콜에 계산 워크플로. 실험적인 측면에 대 한 그것은 돌연변이가지고 중요 한 광범위 한 범위에서 검사할 수 있는 관심의 유전자의 박사 충실 transcriptional 기자 다른 음식 수준에서 유전자의 식 수준을 정할 필요가 있습니다. 우리의 방법에서 설명 하는 전산 분석 수행 수 있도록, 데이터 집합 식 배포판의 의미 있는 견적을 제공 하기 위해 충분 한 크기의 필요 합니다. 비록 우리는 분석에 대 한 템플릿 소스 코드를 제공, 사용자는 우리의 계산 프레임 워크에 걸쳐 광범위 하 게 사용 되는 정보 이론의 언어에 잘 알고 있이 필요가 있다. 소스 코드는 R와 c + +에서 작성 됩니다. 따라서, 프로그래밍 능력의 특정 수준을 의미 있는 방식으로 그들을 적용 하는 데 필요한 이기도 합니다.
여기, 우리는 훨씬 광범위 한 식품 농도 보다 이전에 게시 프로토콜을 캡슐화 하는 식이 제한에 대 한 새로운 방법을 제시. 이 방법은 링크 C. 선 충 박사 문학에서 본 두 이전 별도 현상, 세균성 부족과 수 두 식이 효과 수 있도록 클래식 식이 제한 연구 한 프로토콜. 새로운 확장 범위 박사 패러다임을 사용 하 여, 특정 환경 큐에 응답에 단일 세포 유전자 발현을 검토 하 고이 셀 정보를 인코딩 하는 방법에 대 한 일반적인 프레임 워크 선물이. 우리의 프레임 워크 수명 및 양적 이미지를 각각 수행 하는 방법을 보여 주는 두 개의 실험 프로토콜을 광범위 한 범위에서 이러한 실험 프로토콜에서 박사 데이터 다음 시험 될 수 있다에서 제공 하는 전산 분석 다른 음식 조건에서 변화 유전자 식 수준이 나 수명에 의해 인코딩된 정보를 계량 하이 프레임 워크.
넓은 범위의 박사 패러다임을 사용 하 여 수명 실험 포함 6 가지 음식 수준 (표 1). 이 적은 음식 수준, 규정식 부족10,11 등에서 장 수 검사 또는 먹고 2 유전 배경35를 사용 하 여 보다 더 많은 접근을 필요로 합니다. 그러나, 단일 조건 하에서 수명에서 검토 박사에서 유전자의 역할의 해석을 제한할 수 있습니다. 예를 들어 우리는 최근에 daf-7 돌연변이 야생 타입 동물12 (그림 1A)에 비해 음식 농도에 대 한 응답의 양방향 감쇠는 보여주었다. 식품의 부재, daf-7 돌연변이 야생 타입 동물에 비해 그들의 수명 단축을 표시 합니다. 우리만 식이 부족을 고려 했다, 만약 우리 것 이라고 해석 하는 daf-7 유전자, 만 수명 확장에 필요한 사실 daf-7 역할은 더 복잡 한 되 고. 따라서, 프로토콜의이 부분의 중요 한 결과 여부 관심사의 유전자를 설정 하는 음식에는 전체 수명의 변화에 대응을 변조에 관여입니다.
다른 방법에 비해이 프로토콜의 주요 장점 중 하나 자손 생산 수명 분석을 진행 하는 동물에서을 제거 하는 새로운 방법을 사용 한다는 것입니다. 대부분 연구 약물 FuDR를 사용 하 여 그들을 렌더링 하는 살 균 성인 생식의 확산을 억제. 그러나, 최근 학문 보여주었다 FuDR 치료 수명17,,1819,20,21, 호출 상태 및 유전자 특정 효과 가질 수 있습니다. 그것의 일반적인 적용을 질문입니다. 이 프로토콜에서 자손 생산의 24 시간을 통해 달성 된다 RNAi의 틴 달걀 껍질의 형성을 억제, 계란-5 유전자를 대상으로 동물의 치료 결과에 선 충 C. oocytes 수정 된 그들의 죽음의22,23. 이 방법의 장점은 매우 늦은 연기 고 그래서 C. 선 충에서 장 수의 주요 레 귤 레이 터는 생식 방해 하지 않습니다.
넓은 범위의 박사 프로토콜의 한 잠재적인 경고는 세균성 농도의 꽉 제어 되도록 세균 확산을 제어 하는 항생제의 사용에 대 한 의존도. 벌레의 용기 내의 세균 확산 C. 선 충16에서 죽음의 주요 원인이 될 알려져 있다. 따라서, NGM agar에 carbenicillin 같은 bacteriostatic 항생제를 사용 하 여 세균 확산을 방지 하 고 비 항생제 컨트롤16에 비해 벌레의 수명을 증가. 항생제, 리 팜 피신36 38항생물질 가족37,멤버 등 특정 유형의 박테리아에 미치는 영향에 관계 없이 C. 선 충 에서 수명 연장 표시 되었습니다. 확산입니다. 그러나, carbenicillin 또는 스 세균성 확산에 미치는 영향에 관계 없이 장 수를 증가할 수 있다 문학에서 증거가 있다.
수명 환경 정보, 신경 네트워크, 유전자 발현에 의해 라우팅 생리학에 전송 되는 복잡 한 계산의 출력으로 볼 수 있습니다. 어떻게 특정 유전자를 이해 하는 방법론을 제공 하는 우리의 프로토콜 환경 정보의이 흐름에 영향을 미칠. 이 문제를 해결 하려면 우리는 신뢰할 수 있는 이미지 처리를 단일 세포 수준에서 유전자 식 응답 분포를 결정 해야 합니다. 뿐만 아니라 음식 풍부에서에 유전자 발현의 평균 응답 변경 하지만 또한 큰 인구에서 전체 통계 분포 나타냅니다 우리의 방법의 적용에 대 한 중요 한 요구를 추정 수 있는. 음식 풍부한 유전자 식 응답의 정확한 설명을 특정 뉴런에 의해 정보 뿐만 아니라 신경 회로 의해 고용 된 코딩 전략 계량 정보 이론의 응용 프로그램 수 있습니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 방법의 이미징 및 계산 측면 생물 학적 상황의 큰 집합에 적용 됩니다. 그러나 우리의 작업에서 우리 음식에 관련 된 작은 신경 네트워크에 감지,, 정보 처리 기능 분석에 국한 되지 않습니다 특정 셀 형식이 나 특정 환경 신호 집중. 미래에 이러한 방법론 큰 다양 한 생리 적인 출력에 영향을 미치는 입력된 변수를 잠재적으로 확장할 수 있습니다. 이러한 방식을 어떻게 유전자 규제 네트워크 부호화, 프로세스의 더 큰 이해에 기여 하 고 정보 전송 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 Bargmann 및 Horvitz 실험실을 시 약에 대 한 감사합니다. 일부 변종 CGC, NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 우리는 또한 원고에 대 한 의견 M. Lipovsek 감사합니다. 이 연구는 Wellcome 트러스트 (그랜트 087146 프로젝트: Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 및 BB/M00757X/1 Q.C.), 유럽 연구 위원회 Q.C. (NeuroAge 242666), 미국 국립 보건원 (R01AG035317 및 R01GM088333 H.L.에), 및 미국에 의해 지원 되었다 국립 과학 재단 (H.L., M.Z.에 0946809 GRFP에 0954578).
Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |