Ici, nous présentons un cadre permettant de relier le large éventail de restriction alimentaire à durée de vie et l’expression des gènes. Les auteurs décrivent des protocoles pour large gamme restriction alimentaire et l’imagerie quantitative de l’expression des gènes sous ce paradigme. Nous exposons plus amples analyses informatiques pour révéler qui sous-tendent les fonctions de traitement d’informations des circuits génétiques impliqués dans la détection de nourriture.
Systèmes sensoriels que les animaux puissent détecter, traiter et répondre à leur environnement. Abondance de la nourriture est un signal environnemental qui a des effets profonds sur le comportement et la physiologie animale. Récemment, nous avons démontré que la modulation de la longévité chez le nématode Caenorhabditis elegans , par l’abondance de la nourriture est plus complexe qu’auparavant reconnu. La souplesse de la durée de vie à des changements au niveau alimentaire est déterminée par les gènes spécifiques qui agissent en contrôlant l’informatique au sein d’un circuit neuronal. Notre cadre combine l’analyse génétique, l’imagerie quantitative de haut débit et théorie de l’information. Ici, nous décrivons comment ces techniques peuvent servir à caractériser toute gène qui a une pertinence physiologique au large éventail de restriction alimentaire. Plus précisément, ce flux de travail est conçu pour révéler comment un gène d’intérêt régule la longévité dans le large éventail de restrictions alimentaires ; puis d’établir comment l’expression du gène varie avec le niveau de la nourriture ; et enfin, de fournir une quantification non biaisée de la quantité d’information véhiculée par l’expression des gènes sur l’abondance de la nourriture dans l’environnement. Lorsque plusieurs gènes sont examinés simultanément dans le cadre d’un circuit neuronal, ce flux de travail peut découvrir la stratégie de codage utilisée par le circuit.
Tous les organismes doivent être en mesure de détecter et répondre aux changements dans l’environnement pour assurer leur survie. Chez les animaux, le système nerveux est le premier détecteur et transducteur des informations sur l’environnement et coordonne la réponse physiologique à tout changement qui pourrait affecter la survie de l’organisme1. Abondance de la nourriture est un signal environnemental qui est bien étudié dans plusieurs contextes qui ne régit les comportements liés à l’alimentation, tels que la recherche de nourriture2, mais également une incidence sur la longévité de l’animal. La modulation de la durée de vie par des changements dans l’abondance de la nourriture est un phénomène connu comme restriction alimentaire (DR) et a la conservation évolutive large3.
Le nématode Caenorhabditis elegans est un système puissant modèle pour aborder des questions biologiques fondamentales. Une pléthore de techniques ont été développées qui permettent pour la manipulation du génome du ver, tels que les gènes RNAi et in vivo des techniques d’édition. La petite taille physique du ver et sa transparence optique se prêtent également à en vivo imagerie de reporters fluorescents fois transcriptionnels et translationnelles et l’utilité des technologies à haut débit telles que la microfluidique4. Ensemble, ces outils peuvent être exploitées pour examiner comment neural circuits directs comportement animal.
C. elegans est une communauté et plusieurs méthodes ont été publiées qui permettent un contrôle précis de l’abondance de la nourriture en manipulant la concentration bactérienne5,6,7,8 . Au sein de la communauté de recherche de c. elegans , DR a été étudié dans deux contextes différents. Le premier peut être qualifié de « classique DR », car elle reflète les changements observés en réponse à la baisse des concentrations de nourriture chez d’autres organismes. Dans ce contexte, diminuant l’abondance de la nourriture de ad libitum niveaux résulte en une durée de vie accrue jusqu’à ce qu’un niveau optimal est atteint, après que cette longévité point diminue avec une réduction supplémentaire des aliments6,,7, 9. Le deuxième cadre en vertu duquel le DR a été étudié chez c. elegans est privation alimentaire dont la longévité vers est augmentée par l’élimination complète de toute nourriture bactérienne source10,11. Dans Entchev et al., (2015)12, nous a montré que la complexité de la RD résultant de ces deux paradigmes différents peut être examinée en même temps, dans un contexte, nous appelons « large gamme DR ». En utilisant le protocole décrit ci-dessous, nous avons identifié une nouvelle classe de gènes impliqués dans la DR que dans les deux sens moduler la réponse de l’espérance de vie à l’abondance de nourriture et sont impliqués dans les circuits neuronaux qui détectent la nourriture12 (Figure 1).
La réponse d’un animal aux changements dans l’environnement intègre une séquence de processus biologiques qui relient le système sensoriel à des interactions complexes de régulation véhiculant des informations environnementales à la physiologie. Bien que les détails mécanistiques de ce « flux d’informations » sont souvent inconnues, outils génétiques permet d’acquérir un aperçu de comment ce calcul complex est organisé entre les différentes composantes biologiques. Dans nos travaux récents, nous avons montré que daf-7 et tph-1 sont impliqués dans la transmission des informations environnementales concernant l’abondance de la nourriture grâce à un circuit neuronal détection de nourriture qui module la durée de vie dans c. elegans12 , 13. en appliquant le cadre mathématique de la théorie de l’information14, nous avons été en mesure de quantifier la quantité d’information sur l’environnement, en termes de bits, qui est représentée par les changements d’expression de gène daf-7 et tph-1 dans des neurones spécifiques différents niveaux différents aliments. Sur cette base, nous étions alors en mesure de découvrir la stratégie d’encodage employée par ce circuit neuronal et comment elle est sous contrôle génétique (Figure 2).
Dans le protocole suivant, nous décrivons les étapes requises pour comprendre quels sont les effets des gènes d’intérêt exprimés dans les neurones spécifiques et comment ils participent à la circulation de l’information sur les aliments de l’environnement à durée de vie. De façon générale, notre cadre est divisé en deux protocoles expérimentaux et un flux de travail numérique. Pour les aspects expérimentaux, il est essentiel de disposer des mutants des gènes d’intérêt pouvant être examinés en vertu de la large gamme Dr Faithful transcriptionnelles journalistes sont également nécessaires pour quantifier le niveau d’expression des gènes au niveau de différents aliments. Pour pouvoir effectuer l’analyse computationnelle discuté dans notre méthode, le dataset doit être de dimensions suffisantes pour fournir des estimations significatives des distributions de l’expression. Même si nous fournissons des codes sources de modèle pour les analyses, l’utilisateur doit être familiarisé avec le langage de la théorie de l’information qui est intensivement employé tout au long de notre cadre de calcul. Les codes sources sont rédigés dans R et C++. Par conséquent, un certain niveau de compétence de programmation est également nécessaire de les appliquer d’une manière significative.
Nous présentons ici une nouvelle méthode de restriction alimentaire qui encapsule un plus large éventail de concentrations de nourriture que les protocoles publiés antérieurement. Cette méthode lie deux phénomènes auparavant distinctes chez c. elegans DR littérature, privation bactérienne et classique restriction alimentaire, permettant à ces deux effets alimentaires d’être étudié sous un protocole. En utilisant le nouveau paradigme de DR large éventail, nous présentons un cadre général pour examiner l’expression génique cellulaire unique en réponse à un signal environnemental spécifique et de déterminer comment cette cellule encode les informations. Notre cadre se compose de deux protocoles expérimentaux qui montrent comment exécuter des durées de vie et l’imagerie quantitative, respectivement, en vertu de la large gamme Dr Data de ces protocoles expérimentaux peut ensuite être examiné avec les analyses informatiques fournis dans ce cadre pour quantifier l’information codée par des changements dans les niveaux d’expression de gène ou de la durée de vie dans des conditions alimentaires différents.
Durée de vie des expériences utilisant large gamme DR paradigme comportent six niveaux d’alimentation distinctes (tableau 1). Cela nécessite une approche plus fastidieuse que d’examiner la longévité sous moins de niveaux alimentaires, telles que la privation alimentaire10,11 ou en utilisant le bagage génétique de eat-2 35. Cependant, examinant à durée de vie sous une seule condition peut limiter les interprétations du rôle d’un gène de la RD. Par exemple, nous avons montré récemment que des mutants de daf-7 ont une atténuation bidirectionnelle de la réponse à la concentration de nourriture par rapport au type sauvage animaux12 (Figure 1 a). En l’absence de nourriture, des mutants de daf-7 affichent un raccourcissement de leur durée de vie par rapport aux animaux de type sauvage. Si nous avions considéré seulement comme privation alimentaire, nous qui aurait interprété le gène daf-7 comme étant nécessaires pour une extension de durée de vie, seulement quand en fait le rôle de daf-7 est plus complexe. Par conséquent, le résultat essentiel de cette partie du protocole est d’établir si un gène d’intérêt est impliqué dans la modulation de la réponse globale de la durée de vie aux changements dans l’abondance de la nourriture.
Un avantage majeur de ce protocole par rapport aux autres méthodes, c’est qu’il utilise une nouvelle méthode pour éliminer la production de la progéniture des animaux en cours d’analyse de la durée de vie. La plupart des études utilisent la drogue FuDR pour inhiber la prolifération de la lignée germinale chez les adultes, les rendant stériles. Cependant, les études récentes ont montré FuDR traitement peut avoir des effets de condition – et gène-spécifique sur la durée de vie17,18,19,20,21, remettant en question de son applicabilité générale. Dans ce protocole, élimination de la production de la descendance est assurée à travers un 24h traitement des animaux par ARNi ciblant le gène de l’oeuf-5 , qui inhibe la formation de la coquille de chitine de fécondés c. elegans ovocytes ce qui entraîne leur la mort de22,23. L’avantage de cette méthode est qu’elle est très tardive d’action et donc n’interfère pas avec la lignée germinale, qui est un important régulateur de la longévité chez c. elegans.
Une restriction éventuelle du protocole DR large éventail est sa dépendance sur l’utilisation des antibiotiques pour contrôler la prolifération bactérienne afin d’assurer un contrôle strict de la concentration bactérienne. Une prolifération bactérienne dans l’intestin du ver est connue pour être des principales causes de décès chez c. elegans16. Ainsi, l’utilisation des antibiotiques bactériostatiques, comme la carbénicilline, dans la gélose NGM prévient la prolifération bactérienne et augmente la durée de vie de worms par rapport aux contrôles non antibiotiques16. Certains types d’antibiotiques, tels que la rifampicine36 et membres de la famille37,de tétracycline38, auraient dû être divulgués pour prolonger la durée de vie chez c. elegans indépendamment de leur effet sur les bactéries prolifération. Cependant, il n’y a aucun élément de preuve dans la littérature que carbénicilline ou streptomycine peut augmenter la longévité indépendamment de leur effet sur la prolifération bactérienne.
Durée de vie peut être considérée comme le résultat d’un calcul complex où l’information environnementale, mise en déroute par l’expression génique dans les réseaux neuronaux, est transmise à la physiologie. Notre protocole fournit une méthodologie pour comprendre comment certains gènes affectent ce flux d’information sur l’environnement. Pour répondre à cette question, nous avons besoin pour déterminer la répartition des réponses d’expression de gène au niveau de la cellule unique de traitement d’image fiable. Être capable d’évaluer non seulement la réaction moyenne d’expression génique de changements dans l’abondance de la nourriture mais aussi la distribution statistique complet de grandes populations représente une condition importante pour l’application de notre méthode. Cette description précise des réponses d’expression de gène à l’abondance de nourriture permet à l’application de la théorie de l’information quantifier l’information codée par les neurones spécifiques ainsi que la stratégie de codage utilisé par le circuit neuronal.
Les aspects informatiques et d’imagerie des méthodes décrites dans le présent protocole sont appliquent à un grand ensemble de contextes biologiques. Dans notre travail, nous nous sommes concentrés sur un petit réseau de neurones impliqué dans l’alimentation de détection, cependant, les analyses des fonctionnalités de traitement de l’information ne sont pas limités à un type de cellule spécifique ou des signaux environnementaux spécifiques. À l’avenir, ces méthodologies potentiellement peuvent être étendus qu’à une plus grande variété de variables d’entrées, affectant toute sortie physiologique. Ces approches contribuera à une meilleure compréhension de comment encoder des réseaux de régulation génique, processus et transmettre des informations.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les laboratoires Bargmann et Horvitz pour réactifs. Certaines souches ont été fournis par la CCG, qui est financée par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Nous remercions également M. Lipovsek commentaires sur le manuscrit. Cette recherche a été financée par le Wellcome Trust (projet Grant 087146 de Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 et BB/M00757X/1 à Q.C.), European Research Council (NeuroAge 242666 de Q.C.), US National Institutes of Health (R01AG035317 et R01GM088333 à H.L.) et US National Science Foundation (0954578 à la Chambre des lords, 0946809 GRFP pour M.Z.).
Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |