Här presenterar vi en ram för att avse genuttryck och livslängd bred-range dietrestriktioner. Vi beskriver protokoll för bred-range dietrestriktioner och kvantitativ avbildning av genuttryck under detta paradigm. Vi beskriva ytterligare computational analyser för att avslöja underliggande information bearbetning funktioner av genetiska kretsar involverade i mat-sensing.
Sensoriska system tillåter djur till upptäcka, behandla och bemöta sin omgivning. Mat överflöd är en miljömässig cue som har djupgående konsekvenser för djurens fysiologi och beteende. Vi visade nyligen att modulering av livslängd i Nematoden Caenorhabditis elegans av mat överflöd är mer komplex än tidigare erkänt. Lyhördheten för livslängden till förändringar i mat-nivå bestäms av specifika gener som fungerar genom att kontrollera informationsbehandling inom en neural krets. Vår ram kombinerar genetiska analyser, hög genomströmning kvantitativa imaging och informationsteori. Här beskriver vi hur dessa tekniker kan användas för att karaktärisera någon gen som har en fysiologisk relevans för bred-range dietrestriktioner. Specifikt, är detta arbetsflöde utformad för att avslöja hur en gen av intresse reglerar livslängd under bred-range dietrestriktioner; sedan att fastställa hur uttrycket av genen varierar med mat nivå. och slutligen att ge en objektiv kvantifiering av mängden information förmedlas av genuttryck om mat överflöd i miljön. När flera gener granskas samtidigt under en neural krets kontext, kan detta arbetsflöde avslöja den kodning strategi anställd av kretsen.
Alla organismer behöver för att kunna känna och reagera på förändringar i miljön att säkerställa deras överlevnad. Djur, nervsystemet är den primära detektorn och givaren av information om miljön och samordnar den fysiologiska respons till någon förändring som kan påverka organismens överlevnad1. Mat överflöd är en miljömässig cue som är väl studerat i flera kontexter som inte bara reglerar mat-relaterade beteenden, t ex födosökande2, utan påverkar även livslängden hos ett djur. Moduleringen av livslängden av förändringar i mat överflöd är ett fenomen som kallas dietrestriktioner (DR), och har bred evolutionära bevarande3.
Nematoden Caenorhabditis elegans är en kraftfull modell för grundläggande biologiska frågor. En uppsjö av tekniker har utvecklats som tillåter manipulering av masken genomet, såsom RNAi och i vivo gen redigering tekniker. Den små fysiska storleken på masken och dess optisk transparens lämpar sig också för i vivo imaging av både transkriptionell och translationell fluorescerande reportrar och verktyg av hög genomströmning teknik såsom mikrofluidik4. Tillsammans, kan dessa verktyg utnyttjas för att undersöka hur neurala kretsar direkt djurs beteende.
C. elegans är en bacterivore och flera metoder har publicerats som möjliggör exakt kontroll av mat överflöd genom att manipulera bakteriell koncentration5,6,7,8 . Inom forskarsamhället C. elegans , har DR studerats i två olika sammanhang. Först kan betecknas ‘klassiskt DR’, eftersom den speglar de förändringar sett svar på fallande mat nivåer i andra organismer. I detta sammanhang fallande mat överflöd från ad libitum nivåer resulterar i en ökande livslängd fram till en optimal nås, efter denna punkt livslängd minskar med ytterligare minskning av mat6,7, 9. Andra samband som DR har undersökts i C. elegans är kosten frihetsberövande som ökas livslängden av maskar med fullständig borttagning av någon bakterie mat källa10,11. I Entchev et al. (2015)12, visade vi att komplexiteten i DR som härrör från dessa två olika paradigm kan prövas samtidigt i en annan kontext vi benämner ‘bred-range DR’. Med hjälp av protokollet som beskrivs nedan, vi identifierat en ny klass av gener involverade i DR att dubbelriktat modulera livslängd svaret till mat överflöd och är involverade i neurala kretsar känsla mat12 (figur 1).
Ett djur reagerar på förändringar i miljön integrerar en sekvens av biologiska processer som länkar det sensoriska systemet till komplexa regulatoriska interaktioner förmedla miljöinformation till fysiologi. Trots de mekanistiska detaljerna av sådana ”informationsflödet” är ofta okända, kan genetiska verktyg användas för att förvärva en inblick i hur denna komplexa uträkning är organiserade bland olika biologiska komponenter. I vårt senaste arbete visade vi att daf-7 och tph-1 är inblandade i överföringen av miljöinformation om mat överflöd genom en mat-sensing neural krets som modulerar livslängd i C. elegans12 , 13. genom att tillämpa matematiska ramen för informationsteori14, vi har kunnat kvantifiera mängden miljöinformation, i termer av bits, som representeras av gen uttryck förändringarna i daf-7 och tph-1 i specifika nervceller över olika mat nivåer. Från detta kunde vi sedan avslöja kodning strategin anställd av denna neural krets och hur den styrs genetiskt (figur 2).
I följande protokoll beskriva vi de åtgärder som krävs för att förstå vad effekterna av gener av intresse som uttrycks i särskilda nervceller är och hur de delta till mat informationsflödet från miljö till livslängd. Broady, vårt ramverk är uppdelad i två experimentella protokoll och en computational arbetsflöde. För de experimentella aspekterna, är det viktigt att ha mutanter av generna som kan undersökas under bred-intervall DR. Faithful transkriptionell reportrar är också nödvändigt att kvantifiera nivån uttryck av gener på olika nivåer. För att kunna genomföra den computational analys diskuteras i vår metod, måste datamängden vara av tillräcklig storlek för att ge meningsfull uppskattningar av uttryck-distributioner. Även om vi tillhandahåller mallen källkoder för analyserna, behöver användaren vara förtrogen med språket i informationsteori som används flitigt i hela vår computational ram. Källkoder skrivs i R och C++. Därför krävs också en viss nivå av programmering färdighet att tillämpa dem på ett meningsfullt sätt.
Här presenterar vi en ny metod för dietrestriktioner som kapslar in ett mycket bredare utbud av mat koncentrationer än tidigare publicerade protokoll. Denna metod länkar två tidigare separata fenomen sett i C. elegans DR litteratur, bakteriell deprivation och klassiskt dietrestriktioner, tillåter både kosten effekter vara studerade under ett protokoll. Med den nya breda utbud DR paradigmen, presenterar vi en allmän ram för att undersöka enstaka cell genuttryck som svar på en specifik miljö cue och avgöra hur denna cell kodar information. Vår ram består av två experimentella protokoll som illustrerar hur du utför livslängder och kvantitativa imaging, respektive, enligt bred-range Dr Data från dessa experimentella protokoll kan sedan granskas med computational analyser i denna ram att kvantifiera den information kodad av förändringar i genen uttrycksnivåerna eller livslängder över olika mat villkor.
Livslängd experiment med bred-range DR paradigm involverar sex distinkta mat nivåer (tabell 1). Detta kräver en mer arbetsintensiva metod än att undersöka livslängd under färre mat nivåer, till exempel kosten deprivation10,11 eller använda de äter-2 genetiska bakgrund35. Att pröva på livslängd under ett enda villkor kan dock begränsa tolkningar av en genens roll i DR. Till exempel, visade vi nyligen att daf-7 mutanter har en dubbelriktad dämpning av svar till mat koncentration jämfört med vildtyp djur12 (figur 1A). I avsaknad av mat visas daf-7 mutanter en förkortning av sin livslängd jämfört med vildtyp djur. Om vi hade bara tänkt kosten deprivation, vi skulle ha tolkat som daf-7 genen som nödvändigt för bara livslängd förlängning, när i själva verket daf-7 roll är mer komplex. Kritiska resultatet av denna del av protokollet är därför att fastställa huruvida en gen av intresse är involverad i modulerande livslängd samlade respons på förändringar i mat överflöd.
En stor fördel med detta protokoll jämfört med andra metoder är att den använder en ny metod för att eliminera avkomma produktion i djur som genomgår livslängd analys. De flesta studier använda drogen FuDR för att hämma spridningen av könsceller hos vuxna gör dem sterila. Senare studier har dock visat FuDR behandling kan ha tillstånd – och gen-specifika effekter på livslängd17,18,19,20,21, ringa in fråga dess allmänna tillämplighet. I detta protokoll, eliminering av avkomman produktion uppnås genom en 24 h behandling av djur med RNAi inriktning genen ägg-5 , som hämmar bildandet av de kitin äggskalet av befruktade C. elegans oocyter vilket resulterar i deras död22,23. Fördelen med denna metod är att det är mycket sent verkande och så stör inte de könsceller, som är en viktig regulator av livslängd i C. elegans.
En potentiell varning i bred-range DR protokollet är dess beroende av användningen av antibiotika att styra bakteriell spridning för att säkerställa strikt kontroll av bakteriell koncentration. Bakteriell spridning i tarmen av masken är kända för att vara en viktig orsak till dödsfall i C. elegans16. Således, användning av bakteriostatiska antibiotika, såsom carbenicillin, i NGM agar förhindrar bakteriell spridning och ökar livslängden på maskar jämfört med icke-antibiotika kontroller16. Vissa typer av antibiotika, såsom rifampicin36 och medlemmar av tetracyklin familj37,38, har visat sig förlänga livslängd i C. elegans oberoende av deras inverkan på bakteriell spridning. Det finns dock inga bevis i litteraturen att antingen carbenicillin eller streptomycin kan öka livslängden oberoende av deras effekt på bakteriell spridning.
Livslängd kan ses som resultatet av en komplicerad uträkning där miljöinformation, dirigeras av gen-uttryck i neuronala nätverk överförs till fysiologi. Våra protokoll ger en metod för att förstå hur specifika gener påverkar detta flöde av miljöinformation. För att lösa denna fråga, behöver vi pålitliga bildbehandling för att bestämma fördelningen av gen uttryck svaren på enskild cell nivå. Att kunna uppskatta inte bara den genomsnittliga Svaren av genuttryck till förändringar i mat överflöd men fullständig statistisk fördelningen från stora befolkningar utgör också en viktig förutsättning för tillämpligheten av vår metod. Detta korrekt beskrivning av gen uttryck Svaren till mat överflöd tillåter informationsteori att kvantifiera informationen kodas av specifika nervceller samt kodning strategin anställd av neural krets.
De imaging och computational aspekterna av de metoder som anges i detta protokoll är tillämpligt till en större uppsättning biologiska sammanhang. I vårt arbete, har vi fokuserat på ett litet neurala nätverk involverade i mat avkänning, analyser av information-processing funktioner är dock inte begränsad till en viss cell eller särskilda miljömässiga ledtrådar. I framtiden kan dessa metoder potentiellt utvidgas till en större mängd ingående variablerna, som påverkar alla fysiologiska utdata. Dessa metoder kommer att bidra till en större förståelse för hur gen regleringsnät koda, process och överföra information.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Bargmann och Horvitz labben för reagenser. Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Vi tackar också M. Lipovsek för synpunkter på manuskriptet. Denna forskning stöddes av den Wellcome Trust (Project Grant 087146 till Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 och BB/M00757X/1 till Q.C.), European Research Council (NeuroAge 242666 till Q.C.), oss National Institutes of Health (R01AG035317 och R01GM088333 att H.L.) och U.S. National Science Foundation (0954578 att H.L., 0946809 GRFP att M.Z.).
Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |