हम vivo मेंद्विपक्षीय प्राथमिक somatosensory corticies (एस 1) Thy1-GCaMP6s ट्रांसजेनिक चूहों में 2-फोटॉन (2P) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के ऊपर दोहरी ऑप्टिकल खिड़कियों के माध्यम से ंयूरॉन गतिविधि को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन ।
स्तनधारी मस्तिष्क sagittal विमान भर में समरूपता चिह्नित दर्शाती है । हालांकि, वयस्क स्तनधारी पशुओं में सममित मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका गतिशीलता का विस्तृत विवरण मायावी रहता है । इस अध्ययन में, हम दोहरी ऑप्टिकल खिड़कियों के माध्यम से कैल्शियम गतिशीलता को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन द्विपक्षीय प्राथमिक somatosensory corticies (एस 1) में Thy1-GCaMP6s ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग 2-फोटॉन (2P) माइक्रोस्कोपी. इस विधि रिकॉर्डिंग और द्विपक्षीय माउस मस्तिष्क क्षेत्रों में एक समय में एक ही प्रयोग में एक बार में तंत्रिका गतिविधि की quantifications सक्षम बनाता है vivo मेंएक लंबी अवधि के लिए । इस विधि के मुख्य पहलुओं, जो एक घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है, दोहरी ऑप्टिकल खिड़कियां बनाने के लिए ंयूनतम इनवेसिव सर्जरी प्रक्रियाओं में शामिल हैं, और 2P इमेजिंग का उपयोग करें । हालांकि हम केवल एस सी क्षेत्र में तकनीक का प्रदर्शन, विधि रहने वाले मस्तिष्क के अंय क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है मस्तिष्क तंत्रिका नेटवर्क के संरचनात्मक और कार्यात्मक जटिलताओं के elucidation सुविधा ।
कैल्शियम और उसके विनियमन एकाधिक शारीरिक प्रक्रियाओं मध्यस्थता में आवश्यक हैं. निगरानी कैल्शियम गतिशीलता सामान्य मस्तिष्क समारोह के साथ ही मस्तिष्क विकारों के रोग की स्थिति को समझने के लिए उपयोगी है 1,2,3,4,5,6 ,7,8. इमेजिंग GCaMP6s प्रतिदीप्ति स्पाइक संख्या, समय, और आवृत्ति को बढ़ाता है, साथ ही दोनों विट्रो में और vivo 9,10,11में synaptic इनपुट के स्तर के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है ।
स्तनधारी मस्तिष्क sagittal विमान भर में समरूपता चिह्नित दर्शाती है । हालांकि हाल ही में स्नायविक अनुसंधान cortical remodeling और न्यूरॉन दर्दनाक मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी की चोट 6,7द्वारा ट्रिगर गतिविधि पर प्रकाश डाला गया है, भूमिका है कि सममित इसी क्षेत्रों के बरकरार ऊतक खेलने वसूली में अभी भी अस्पष्ट हैं ।
इस अध्ययन में, हम vivo इमेजिंग में द्विपक्षीय सममित ऑप्टिकल खिड़कियां बनाने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन । इन ऑप्टिकल खिड़कियों का प्रयोग, हम प्राथमिक somatosensory cortices (एस सी) से GCaMP6s ट्रांसजेनिक चूहों में 2P माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने से कैल्शियम की गतिशीलता को मापने का वर्णन । परिणाम अनुभाग में, हम भी EGFP ट्रांसजेनिक 2P इमेजिंग का उपयोग चूहों में एस सी क्षेत्र में अलग समय बिंदुओं पर vivo वृक्ष आकृति विज्ञान में दिखा । अवलोकन द्विपक्षीय एस सी क्षेत्रों में नेटवर्क गतिशीलता के बारे में विधि है, लेकिन कैसे दोहरी खुला कपाल खिड़कियों की एक प्रारंभिक उदाहरण के neuroscientists में मदद मिलेगी स्थानीय और सममित जानकारी सामांय में वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क में प्रसंस्करण की जांच स्थिति या vivo मेंअलग रोग मॉडल में ।
दो-फोटॉन इमेजिंग मस्तिष्क की सतह के नीचे लगभग ८०० µm तक एक उचित प्रस्ताव पर कई कोशिकाओं की गतिविधि के एक साथ माप को सक्षम करता है । हम एकीकृत 2P और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग GCaMP6s के साथ एक दोहरी ऑप्टिकल खिड़की तकनीक परत वी न्यूरॉन सोमता की आबादी में कैल्शियम गतिशीलता निरीक्षण करने के लिए स्थित पिया के नीचे 500 µm >. खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष पर एक खुला ऑप्टिकल खिड़की के साथ, विधि vivo मेंलंबे समय तक और स्थिर कैल्शियम इमेजिंग के लिए सममित स्तनधारी मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका गतिविधि की रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है । इस विधि के मुख्य पहलुओं दोहरे खुले खोपड़ी ऑप्टिकल खिड़कियां बनाने के लिए न्यूनतम इनवेसिव सर्जरी के प्रदर्शन में शामिल हैं और 2P सममित s क्षेत्र में ंयूरॉंस गतिविधि की इमेजिंग ।
द्विपक्षीय एस सी क्षेत्र में नेटवर्क गतिविधि की जांच कैसे दोहरी कपाल खिड़कियों का एक उदाहरण है vivo मेंवयस्क मस्तिष्क में स्थानीय और सममित जानकारी प्रसंस्करण जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस विधि भी (उदाहरण के लिए Thy1-GCaMP6s चूहों का उपयोग करते हुए) ंयूरॉन गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और cortical प्लास्टिक के बी-6 । तटरक्षक टीजी (Thy1-YFP) एक एकतरफा सीएनएस चोट के कारण deafferentation के बाद वसूली में इसी सममित क्षेत्रों के बरकरार ऊतक से HJrs/जे । विधि भी परिधीय उत्तेजना रणनीतियों जैसे optogenetic, बिजली या रासायनिक उत्तेजना के जवाब में cortical गतिविधि की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि हम केवल एस 1 क्षेत्र में तकनीक का प्रदर्शन, इस दृष्टिकोण ऐसे रहने वाले मस्तिष्क में अंय सममित क्षेत्रों में गतिविधियों की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है जैसे प्राथमिक मोटर प्रांतस्था (M1) के स्तर V ंयूरॉंस । मस्तिष्क क्षेत्रों के पुनर्गठन पर टिप्पणियों अनुकूली मोटर व्यवहार है, जो समारोह के postinjury वसूली में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है के लिए एक तंत्रिका सब्सट्रेट प्रदान कर सकते हैं । यह भी सिर तय चूहों में व्यवहार के दौरान आनुवंशिक रूप से पहचान की कोशिकाओं के सममित गतिविधि की पुरानी माप के लिए अनुमति देता है ।
तकनीकी तौर पर, जांचकर्ताओं की गुणवत्ता और दोहरी कपाल खिड़कियों की निरंतरता के लिए सावधान ध्यान देना चाहिए । thinned-खोपड़ी कपाल खिड़की तकनीक 12 अत्यधिक अभ्यास करने के लिए शुरुआती के लिए सिफारिश की है । spins उनकी आकृति विज्ञान और स्थानीय आमद और बाहर निकालना तंत्र की वजह से कैल्शियम डिब्बों रहे हैं । इस अध्ययन में, हम बी-6 का इस्तेमाल किया । सीजी-टीजी (Thy1-YFP) HJrs/जे चूहों एक उदाहरण के रूप में vivo में वृक्ष रीढ़ की गतिशीलता (चित्रा 4) प्रदर्शित करने के लिए । एक खुली खोपड़ी ग्लास खिड़की अधिष्ठापन उच्च रीढ़ के कारोबार और प्रतिक्रियाशील glial प्रतिक्रियाओं के बाद सर्जरी के 12कारण हो सकता है । इसके विपरीत, पतली खोपड़ी खिड़की तकनीक के साथ, spins और dendrites अच्छी तरह से संरक्षित किया जा सकता है ।
आयामों और ऑप्टिकल खिड़कियों की मोटाई के विकल्प को देखने के वांछित क्षेत्र पर निर्भर हो जाएगा, खोपड़ी वक्रता, खोपड़ी मोटाई, और इमेजिंग 13के प्रकार । बाडी पर ऑप्टिकल coverglasses के अपर्याप्त दबाव के कारण बाडी का मोटा होना, खोपड़ी का पुनर्विकास, और मस्तिष्क गति में वृद्धि हो सकती है । इसके विपरीत, ऑप्टिकल coverglasses के अत्यधिक दबाव cortical रक्त प्रवाह में बाधा हो सकती है ।
ऑप्टिकल विंडो असेंबली, गोंद और coverglasses के अतिरिक्त परतों के इलाज के लिए एक समय में एक ऑप्टिकल चिपकने वाला और लंबी तरंग दैर्ध्य यूवी प्रकाश के साथ । मदद करने के लिए चिपकने वाला संबंध मजबूत बनाने के लिए, एक मशीन में गढ़े खिड़की (12 घंटे के लिए ५० डिग्री सेल्सियस) गर्म । ७०% में ऑप्टिकल विंडो coverglass स्टोर (vol/इथेनॉल और, सर्जरी से पहले, यह बाँझ खारा के साथ कुल्ला । ऑप्टिकल विंडो खामियों के लिए जांच की जरूरत है (जैसे ऑप्टिकल चिपकने वाला या गलत संरेखण की एक ग़लत मात्रा के रूप में) एक stereoscope के तहत विफलता से बचने के लिए उपयोग करने से पहले । यदि ऑप्टिकल चिपकने वाला बहुत पतली है, हवा रिक्त स्थान, जो ऑप्टिकल विचलन या कवर कांच टुकड़ी आरोपण पर पैदा कर सकता है हो सकता है । इसके विपरीत, बहुत अधिक ऑप्टिकल चिपकने वाला ओवरफ़्लो पिछले कपाल विंडो के किनारों के कारण कर सकते हैं ।
संक्षेप में, यहां हम Thy1-GCaMP6s और Thy1-YFP ट्रांसजेनिक चूहों में 2 सममित प्राथमिक somatosensory cortical क्षेत्रों से कपाल खिड़कियों के माध्यम से कैल्शियम की गतिशीलता या वृक्ष आकृति विज्ञान को मापने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन, क्रमशः, 2P माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । इस तकनीक को बहुत जटिल संरचनात्मक और कार्यात्मक तंत्रिका नेटवर्क के संबंध विदारक सुविधा हो सकती है ।
The authors have nothing to disclose.
हम बहुत आभारी है Wenbiao (Skirball संस्थान, शरीर विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान विभाग, ंयूयॉर्क के विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन, संयुक्त राज्य अमेरिका) के लिए उत्कृष्ट तकनीकी मार्गदर्शन और पटी Raley, चिकित्सा संपादक (स्नायविक सर्जरी विभाग, इंडियाना यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन), पांडुलिपि के संपादन के लिए. हम Dr. Jinhui चेन (स्टार्क तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान संस्थान, इंडियाना विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन, संयुक्त राज्य अमेरिका) बी-6 प्रदान करने के लिए धंयवाद । तटरक्षक-टीजी (Thy1-YFP) HJrs/जे चूहों । यह काम जिनान सैन्य क्षेत्र के चाईनीज पीएलए 2016ZD03 (XJL), और NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562 के जनरल हॉस्पिटल के निदेशक की फाउंडेशन द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, दिग्गजों के अमेरिकी विभाग से मेरिट रिव्यू अवार्ड I01 BX002356 मामले, क्रेग एच नेलसन फाउंडेशन २९६७४९, इंडियाना रीढ़ की हड्डी और ब्रेन इंजरी रिसर्च फाउंडेशन, मारी Hulman जॉर्ज बंदोबस्ती कोष (XMX) ।
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | – | – | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |