생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출
Summary
Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.
Abstract
미토 콘 드리 아 셀의 강국입니다 그리고 ATP의 형태로 세포 에너지를 생산. 미토 콘 드 리아 기능 장애는 생물학적 노화 및 질환 대사 질환, 조기 노화 증후군, Alzheimer의 질병 (광고) 및 파 킨 슨 병 (PD)와 같은 신경 퇴행 성 질환 등의 다양 한에 기여 한다. 미토 콘 드리 아 건강의 유지 보수는 미토 콘 드리 아 속 mitophagy 통해 역 기능 mitochondria의 효율적 허가에 따라 다릅니다. 정확 하 게 감지 하 autophagy/mitophagy, 특히 동물 모델 실험 방법 개발에 도전 있다. Mitophagy의 분자 메커니즘의 이해로 최근 진행은 소설 mitophagy 탐지 기술 개발을 활성화 하 고 있다. 여기, 인간의 세포, 꼬마 선 충 mitophagy 모니터 여러 다양 한 기법 소개 (예를 들어, 윈저 DCT-1 / 하는지 1 긴장), 마우스 (mt Keima). 간 종 평가 포함 하 여 이러한 mitophagy 탐지 기술의 조합 mitophagy 측정의 정확도 개선 하 고 mitophagy 건강과 질병에서의 역할의 더 나은 이해로 이어질.
Introduction
Mitophagy은 미토 콘 드리 아 유지 보수를 위해 필수적 이다. 미토 콘 드리 아 여러 세포 신호 경로 교차 하 고 보편적인 하위 세포 세포 세포 에너지 생산과 세포 물질 대사, 칼슘 항상성1,2,3, 에 대 한 책임은 4. 미토 콘 드리 아 끊임없이 경험 반응성 산소 종 (선생님)와 미토 콘 드리 아 이용과 같은 내 인 성 및 외 인 근원에서 과제 각각, “세”와 역 기능 mitochondria의 세대 이끌어 내는. 손상 된 미토 콘 드리 아의 축적 유해한 ROS의 양을 증가 하는 동안 ATP 생산의 효율성을 감소 하 고 대사 질환, 광고, 같은 나이 관련 된 질병에 연결 되었다 PD1,5,6 . 유도 미토 콘 드리 아 세포 역 기능을 방지 하기 위해 셀 필요가 특히 미토 콘 드리 아를 손상 인식 하 고 효율적으로 세포 과정을 통해 그들을 제거 미토 콘 드 리아 autophagy를 (mitophagy) 불린다. 이 mitophagy 건강에서의 중요성을 설명 하 고 질병 검색 mitophagy 정확 하 고 효율적인 방법에 대 한 필요성을 보여줍니다 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.
Mitophagy는 많은 단백질과 단백질 단지5,,78와 관련 된 여러 단계 프로세스입니다. 간단 하 게, 손상 된 mitochondrion 처음 인식 이며9,10플라즈마 멤브레인, 바인딩과 그물, 골 단지, 핵, 또는 mitochondrion 자체에서 발생 한 수 있습니다 더블 membraned phagophore에 의해 잠겼습니다. 구형 phagophore elongates 및 결국 미토 콘 드리 아 autophagosome (mitophagosome) 구성 안에 미토 콘 드리 아를 봉인. mitophagosome 다음 성능 저하, 형성 하는 autolysosome는 손상된 mitochondrion 저하 및 재활용7,8은 리소좀으로 퓨즈. 또한 mitophagy에 관련 된 주요 autophagic 단백질 포함: Autophagy 관련 7 (ATG7) 및 Beclin1 (개시), Microtubule-Associated 단백질 1A/1B-라이트 3 (LC3-II) ( C. elegans에서 하는지-1)과 p62 체인 (phagophore의 구성 요소), 그리고 관련 된 lysosomal 막 당단백질 2 (LAMP2)6,7. 또한, PTEN 유도 상 상속 키 니 아 제 1 (핑크-1), Parkin1, 핵 점 단백질 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 상호 작용 단백질 3 처럼 (닉스/BNIP3L) (DCT-1 C. 선 충)를 포함 하 여 mitophagy에 고유한 여러 가지 필수적인 단백질은 다른 사람의 사이에서5,6,11.
Autophagy의 수준에서 변화를 감지 하는 일반적인 방법은 LC3-II/LC3-나의 LC3-II/말라 비율입니다. 그러나,이 메서드는 일반적인,이 비율 증가 증가 개시 또는 리소좀12mitophagosome의 장애인된 융합 반영 수 있습니다. 또 다른 방법은 없는 autophagy 마커 (예를 들어, LC3)와 미토 콘 드리 아 단백질 (예를 들어, Translocase의 외부 미토 콘 드리 아 막 20 (TOMM20, proteasomes에 의해 타락 될 수 있는)) 사이 colocalization를 평가 하는 것입니다. 그러나,이 수만 총 mitophagy 수준에서 변경 내용을 나타내고는 단계를 구별할 수 없습니다 어떤 막힘에 발생 합니다. 이 mitophagosomes의 축적을 병렬로 lysosomal 억제제 (예를 들어, E64d + Pepstatin A, EP에 게 불리는)를 사용 하 여 명백 하 게 될 수 있습니다. Mitophagosomes EP와 치료 다음과의 수와 초기에 mitophagosomes의 수의 차이 mitophagy를 나타낼 수 있습니다. 이러한 제한에는 소설 mitophagy 탐지 기술의 개발 라는 메시지가 있다. 인간의 질병의 넓은 스펙트럼에 mitophagy의 증가 관련성에 비추어 우리 연구원에 대 한 도움이 될 수 있습니다 몇 가지 강력한 mitophagy 탐지 기법 제시. 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 기술을 커버 하 고 mitophagy의 변경 사항을 확인 하려면 여러 기술을 결합 하는 것이 좋습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitophagy의 정확한 측정은 기술적으로 요구 하 고 있다. 여기, 우리는 mitophagy의 질적 모두 검출 및 정량화의 가장 일반적인 실험실 실험 모델 mitophagy 수준에 대 한 허용 하는 여러 가지 강력한 기법 제시.
복제할 데이터를 얻기 위해 적어도 3 개의 생물 학적 반복 된 실험 설계는 필요 하다. 실험 및 분석에 관련 된 모든 연구 실험 그룹 id에 멀게 합니다. 또한, 필드 이미징 선택 되…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 박사 아츠 시 미 야와 키와 박사 리처드 J. Youle mt Keima 플라스 미드를 공유 하기 위한 감사 및 mt Keima 통합 Hela 세포. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 Raghavendra A. Shamanna와 박사 데보라 L. Croteau 감사합니다. 이 연구는 NIH (VAB)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다, 노화, 2014-2015 년에 국립 연구소와 NIA 2016-2017 내부 실험실 (EFF, VAB) 부여 합니다. EFF HELSE 대단히 OST RHF에 의해 지원 되었다 (프로젝트 No: 2017056)와 노르웨이의 연구 위원회 (프로젝트 No: 262175).
작가 기부:
EFF는 원고를 설계 하 고 준비 초안; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH, 그리고에 드 쓴 다른 부분의 종이; NT, JP, HN, VAB 개정 원고와 전문성을 제공.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
Riferimenti
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
- Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
- Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2012).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
- Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
- Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).
