In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi
Summary
Mitophagy, il processo di schiarimento danneggiato i mitocondri, è necessario per la manutenzione di salute e omeostasi mitocondriale. Questo articolo presenta alcune delle mitophagy più recenti metodi di rilevazione in Caenorhabditis eleganse cellule umane in topi.
Abstract
I mitocondri sono le centrali elettriche delle cellule e producono energia cellulare sotto forma di ATP. La disfunzione mitocondriale contribuisce all’invecchiamento biologico e una vasta gamma di disturbi tra cui malattie metaboliche, sindromi di invecchiamento precoce e malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio) e malattia di Parkinson (MDP). Mantenimento della salute mitocondriale dipende la biogenesi mitocondriale e la liquidazione efficiente dei mitocondri disfunzionali attraverso mitophagy. Metodi sperimentali per rilevare con precisione l’autofagia/mitophagy, soprattutto nei modelli animali, hanno state difficili da sviluppare. Recenti progressi verso la comprensione dei meccanismi molecolari di mitophagy ha permesso lo sviluppo di tecniche di rilevamento del romanzo mitophagy. Presentiamo il versatile diverse tecniche per monitorare mitophagy in cellule umane, Caenorhabditis elegans (ad es., Rosella e ceppi DCT-1 / LGG-1) e topi (mt-Keima). Una combinazione di queste tecniche di rilevamento mitophagy, inclusa la valutazione inter-specie, migliorerà l’accuratezza delle misurazioni mitophagy e portare a una migliore comprensione del ruolo della mitophagy nella salute e nella malattia.
Introduction
Mitophagy è essenziale per manutenzione mitocondriale. I mitocondri si intersecano molteplici vie di segnalazione delle cellule e sono universale degli organelli sub-cellulari responsabili della produzione di energia cellulare, metabolismo cellulare e calcio omeostasi1,2,3, 4. i mitocondri costantemente esperienza sfide da fonti endogene ed esogene, come specie reattive dell’ossigeno (ROS) e sostanze tossiche mitocondriale, rispettivamente, che portano alla generazione dei mitocondri disfunzionali e “invecchiati”. Accumulazione dei mitocondri danneggiati diminuisce l’efficienza di produzione di ATP aumentando la quantità di ROS è nocivo ed è stato collegato alle malattie età-correlate quali malattie metaboliche, annuncio e PD1,5,6 . Per evitare che i mitocondri indotti disfunzione cellulare, cellule hanno bisogno di riconoscere specificamente danneggiato i mitocondri e rimuoverli in modo efficiente attraverso un processo cellulare chiamato autophagy mitocondriale (mitophagy). Questo ha dimostrato importanza di mitophagy in salute e malattia illustra l’esigenza di precisi ed efficienti metodi rilevare mitophagy sia in vitro che in vivo.
Mitophagy è un processo di più-passaggio che coinvolge molte proteine e proteina complessi5,7,8. In breve, un mitocondrio danneggiato è in primo luogo riconosciuto e inghiottito da un phagophore a membrana doppia, che può provenire dalla membrana plasmatica, del reticolo endoplasmatico, complesso di Golgi, nucleo o mitocondrio stesso9,10. Il phagophore sferica si allunga e alla fine sigilla i mitocondri all’interno, che costituiscono l’autofagosoma mitocondriale (mitophagosome). Il mitophagosome si fonde quindi con il lisosoma per degradazione, formando un autolisosoma in cui il mitocondrio danneggiato è degradato e riciclato7,8. Principali proteine autofagica anche coinvolti in mitophagy includono: Autophagy correlate 7 (ATG7) e Beclin1 (iniziazione), Microtubule-Associated proteina 1A/1B-Light Chain 3 (LC3-II) (LGG-1 in elegan c.s) e p62 (componenti di phagophore), e glicoproteina di membrana lisosomiale associati 2 (LAMP2)6,7. In aggiunta, ci sono parecchie proteine essenziali unico a mitophagy, tra cui indotta da PTEN putativo chinasi 1 (rosa-1), proteina nucleare Dot 52 kDa (NDP52), Parkin1, optineurin, BCL2 interazione proteina 3 come (NIX/BNIP3L) (DCT-1 c.elegans), tra gli altri5,6,11.
Un metodo comune per rilevare i cambiamenti nei livelli dell’autofagia è con il rapporto di LC3-II/LC3-I o LC3-II/actina. Tuttavia, questo metodo è non specifico, come un aumento di questo rapporto può riflettere un’iniziazione maggiore o un’alterata fusione di mitophagosome al lisosoma12. Un altro metodo è quello di valutare la colocalizzazione tra un marcatore di autofagia (ad es., LC3) e una proteina mitocondriale (ad es., Translocase di Outer mitocondriale della membrana 20 (TOMM20, che potrebbe essere degradata da proteosomi)). Tuttavia, questo può solo indicare cambiamenti nei livelli di totale mitophagy e non riesce a distinguere il passo (s) al quale blocco si verifica. Questo può essere chiarito utilizzando lysosomal inibitori (ad es., A E64d + pepstatina, chiamato EP) in parallelo per causare l’accumulo di mitophagosomes. La differenza tra il numero di mitophagosomes alla linea di base e il numero di mitophagosomes dopo il trattamento con EP può indicare mitophagy. Queste limitazioni hanno richiesto lo sviluppo di tecniche di rilevamento del romanzo mitophagy. In considerazione della crescente importanza di mitophagy in un ampio spettro di malattie umane, vi presentiamo diverse tecniche di rilevamento mitophagy robusto che possono essere utile per i ricercatori. Copriamo le tecniche sia in vitro che in vivo e consiglia di combinare le tecniche multiple per verificare le modifiche di mitophagy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Misurazione accurata di mitophagy è tecnicamente impegnativo. Qui, abbiamo presentato diverse tecniche robuste che consentono entrambi rilevazione qualitativa di mitophagy e quantificazione dei livelli di mitophagy nei modelli sperimentali di laboratorio più comuni.
Acquisire dati replicabili, un disegno sperimentale con almeno tre ripetizioni biologiche è necessario. Tutti i ricercatori coinvolti nella sperimentazione e analisi devono essere accecati alle identità di gruppo sperimentale. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Dr. Atsushi Miyawaki e Dr. Richard J. Youle per aver condiviso il plasmide Keima mt e mt-Keima integrato cellule Hela. Ringraziamo Raghavendra A. Shamanna e Dr. Deborah L. Croteau per la lettura critica del manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale di NIH (VAB), Istituto nazionale su invecchiamento, nonché un 2014-2015 e 2016-2017 NIA intra-laboratorio concedere (FEP, VAB). FEP è stata sostenuta da HELSE SOR-OST RHF (progetto No: 2017056) e il Consiglio di ricerca di Norvegia (progetto No: 262175).
AUTORE DI CONTRIBUTI:
FEP progettato il manoscritto ed elaborato il progetto; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH ed ED ha scritto diverse sezioni del libro; NT, JP, HN e VAB rivisto il manoscritto e fornito competenze.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
Riferimenti
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