Summary

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Published: November 22, 2017
doi:

Summary

Mitophagy, den Prozess der Clearing beschädigt Mitochondrien ist für mitochondriale Homöostase und Gesundheit Wartung notwendig. Dieser Artikel stellt einige der neuesten Mitophagy Nachweismethoden in menschlichen Zellen, Caenorhabditis Elegansund Mäuse.

Abstract

Mitochondrien sind die Kraftwerke der Zellen und zelluläre Energie in Form von ATP zu produzieren. Mitochondriale Dysfunktion trägt zur biologische Alterung und einer Vielzahl von Erkrankungen einschließlich Stoffwechselerkrankungen, vorzeitiges Altern Syndrome und neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD) und der Parkinson-Krankheit (PD). Erhaltung der mitochondrialen Gesundheit hängt von mitochondrialen Biogenese und die effiziente Abfertigung der dysfunktionalen Mitochondrien durch Mitophagy. Experimentelle Methoden genau Autophagie/Mitophagy, vor allem in Tiermodellen zu erkennen haben, entwickeln streitig gemacht. Jüngste Fortschritte in Richtung auf das Verständnis der molekularen Mechanismen des Mitophagy ermöglichte die Entwicklung von neuartigen Mitophagy Nachweistechniken. Hier stellen wir einige vielseitige Techniken zur Überwachung der Mitophagy in den menschlichen Zellen, Caenorhabditis Elegans (z.B.Rosella und DCT-1 / LGG-1-Stämme), und Mäuse (Mt-Otamegane). Eine Kombination dieser Mitophagy Erkennung Techniken, einschließlich Cross-Arten Bewertung, verbessert die Genauigkeit der Mitophagy Messungen und führen zu einem besseren Verständnis der Rolle der Mitophagy in Gesundheit und Krankheit.

Introduction

Mitophagy ist für mitochondriale Wartung unerlässlich. Mitochondrien kreuzen sich mehrere Zelle Signalwege und sind universelle subzellulären Organellen verantwortlich für zelluläre Energieproduktion, Zellstoffwechsel und Kalzium Homöostase1,2,3, 4. Mitochondrien erleben ständig Herausforderungen von endogenen und exogenen Quellen wie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und mitochondriale Giftstoffe, bzw. die zu der Generation von “Alter” und dysfunktionale Mitochondrien führen. Ansammlung von Geschädigten Mitochondrien verringert die Effizienz der ATP Produktion bei gleichzeitiger Erhöhung der Menge an schädlichen ROS und altersbedingten Krankheiten wie Stoffwechselerkrankungen, AD, verbunden worden und PD1,5,6 . Zur Vermeidung von Mitochondrien induziert zellulären Dysfunktion bezeichnet Zellen spezifisch erkennen Mitochondrien beschädigt und effizient durch ein zellulärer Prozess zu entfernen müssten mitochondriale Autophagie (Mitophagy). Dies demonstriert Bedeutung von Mitophagy in Gesundheit und Krankheit verdeutlicht die Notwendigkeit für präzise und effiziente Methoden, um Mitophagy zu erkennen in Vitro und in Vivo.

Mitophagy erfolgt in mehreren Schritten mit vielen Proteinen und Protein-komplexe5,7,8. Kurz gesagt, eine beschädigte Mitochondrium zuerst erkannt und verschlungen durch ein Doppel-membraned Phagophore, die von der Plasmamembran, endoplasmatische Retikulum, Golgi-Komplex, Zellkern oder Mitochondrium selbst9,10stammen kann. Die sphärischen Phagophore verlängert und schließlich dichtet die Mitochondrien im Inneren bilden die mitochondriale Autophagosome (Mitophagosome). Die Mitophagosome verschmilzt dann mit den Lysosomen für Abbau, bilden eine Autolysosome, in dem die beschädigten Mitochondrium degradiert und recycelten7,8ist. Große selbstverdauende Proteine, die auch in Mitophagy enthalten: Autophagie Verwandte 7 (ATG7) und Beclin1 (Einleitung), Microtubule-Associated Protein 1A/1 b-Light Chain 3 (LC3-II) (LGG-1 in C. Munders) und p62 (Komponenten des Phagophore), und lysosomale verbundene Membran Glykoprotein 2 (LAMP2)6,7. Darüber hinaus gibt es mehrere wichtige Proteine für Mitophagy, einschließlich PTEN-induzierte vermeintliche Kinase 1 (Rosa-1), Parkin1, nukleare Dot Protein 52 kDa (NDP52), Optineurin, BCL2 Interaktion Protein 3 wie (NIX/BNIP3L) (DCT-1 in C. Elegans), eindeutig unter anderem5,6,11.

Eine gängige Methode zum Erkennen von Änderungen in Höhe der Autophagie ist durch das Verhältnis der LC3-II/LC3-I oder LC3-II/Aktin. Diese Methode ist jedoch unspezifisch, wie eine Erhöhung dieses Verhältnis entweder eine erhöhte Initiation oder eine beeinträchtigte Mischung aus Mitophagosome, Lysosomen12widerspiegeln kann. Eine weitere Methode ist die NS1 zwischen einer Autophagie Marker (z.B.LC3) und eines mitochondrialen Proteins (z.B.Translocase der äußeren mitochondrialen Membran 20 (TOMM20, die durch Proteasomen beeinträchtigt werden könnte)) zu bewerten. Allerdings können nur Änderungen im gesamten Mitophagy Ebenen anzugeben und nicht unterscheiden, den Schritt an die Verstopfung auftritt. Dies kann mithilfe von lysosomalen Inhibitoren (z. B.E64d + Pepstatin A, EP genannt) parallel dazu führen, dass die Anhäufung von Mitophagosomes geklärt werden. Der Unterschied zwischen der Anzahl der Mitophagosomes an der Basislinie und die Anzahl der Mitophagosomes nach der Behandlung mit EP kann Mitophagy angeben. Diese Einschränkungen haben die Entwicklung von neuartigen Mitophagy Nachweistechniken aufgefordert. Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung der Mitophagy in einem breiten Spektrum von Erkrankungen des Menschen stellen wir mehrere robuste Mitophagy Erkennungstechniken, die für Forscher nützlich sein können. Wir decken sowohl in Vitro und in Vivo Techniken und empfehlen kombinieren mehrere Techniken, um Änderungen der Mitophagy zu überprüfen.

Protocol

Tiere (männlichen und weiblichen Mäusen) geboren und aufgewachsen in einer akkreditierten Tierhaus in Übereinstimmung und Genehmigung des NIH Animal Care und Verwendung. Euthanasie Methoden müssen mit allen nationalen und institutionellen Regelungen übereinstimmen. 1. Erkennung von Mitophagy in menschlichen Zellen Erkennung von Mitophagy mit Mt-Otamegane plasmidHinweis: Das Otamegane Protein, verschmolzen zu einem Mitochondrien Ziel Signal, als Mt-Otamegane …

Representative Results

Erkennung von Mitophagy in menschlichen Zellen: Bei der hier vorgestellten Verfahren wurden menschliche HeLa-Zellen mit Mt-Otamegane Plasmid transfiziert. Gesunde Zellen zeigten ein gut organisiertes mitochondriale Netz (GFP, 488 nm) mit wenigen Fälle von Mitophagy (RFP, 561 nm). Allerdings Zellen vorbehandelt mit einer mitochondrialen Entkuppler FCCP (30 µM für 3 h) eine tiefgreifende Steigerung im Mitophagy auftreten (<strong …

Discussion

Genaue Messung des Mitophagy ist technisch anspruchsvoll. Hier haben wir mehrere robuste Techniken vorgestellt, die sowohl qualitativen Nachweis von Mitophagy und Quantifizierung der Mitophagy Ebenen in alle gängigen Labor experimentelle Modelle ermöglichen.

Um reproduzierbare Daten zu erhalten, ist ein experimentelles Design mit mindestens drei biologische Wiederholungen notwendig. Alle Forscher in Experimenten und Analyse beteiligt müssen experimentelle Gruppe Identitäten Blenden zu lass…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Atsushi Miyawaki und Dr. Richard J. Youle für den Austausch der Mt-Otamegane Plasmid und Mt-Otamegane integriert Hela-Zellen. Raghavendra A. Shamanna und Dr. Deborah L. Croteau danken wir für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Forschung durch den intramuralen Forschungsprogramm des NIH (VAB) unterstützt wurde, Nationales Institut auf Altern sowie ein 2014-2015 und 2016-2017 NIA Intra-Labor (EFF, VAB) gewähren. EFF wurde unterstützt durch das SOR-OST RHF (Projekt Nr.: 2017056) und Research Council of Norway (Projekt-Nr.: 262175).

AUTOR BEITRÄGE:

EFF gestaltet das Manuskript und den Entwurf; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH und ED schrieb verschiedene Abschnitte des Papiers; NT, JP, HN und VAB überarbeitet das Manuskript und Know-how zur Verfügung.

Materials

mt-Keima mouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent Thermofisher #11668027
Opti-MEM medium (Gibco) Thermofisher #31985062 serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima addgene #72342
COXII antibody (mouse) abcam #ab110258
LAMP2 antibody (rabbit) NOVUS #CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) Thermofisher #Z25306 Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) Thermofisher #Z25002 Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI Invitrogen #P36931
6-well plate SIGMA
Corning Costar
#CLS3516
4-well chamber slide THermofisher, Nunc Lab-Tek #171080
Nunc F 96-well plate Thermofisher #152038
LC3B antibody rabbit NOVUS #NB100-2220
DNA antibody Progen Biotechnik #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI Thermofisher #D1306 antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader ) GE Healthcare Life Sciences #IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope Nikon #TE-2000e
Colocalization software Volocity #Volocity 6.3 alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software GE Healthcare Life Sciences #28408974
cell culture medium Thermofisher #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher #15140122
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich #12003C-1000ML
Cell culture Incubator Thermofisher #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope Zeiss Zeiss Axio Imager Z2
camera Olympus Olympus DP71
confocal microscope Zeiss Zeiss Axio Observer Z1
confocal software Zeiss ZEN 2012
image analysis software Image J colocalization analysis, etc https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software GraphPad Software Inc., San Diego, USA GraphPad Prism software package
material to make a worm pick Surepure Chemetals #4655 The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1 Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution see supplementary data for preparation
M9 buffer see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips Fisher Scientific #B9992000
Surgical forceps STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS Thermofisher #AM9625 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker Fisher Scientific #11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad see supplementary data for preparation
Vibroslice blades World precision instruments #BLADES-2 single-edge blade
metal plate MSC #78803988 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100 detergent
Methyl viologen dichloride hydrate Sigma-Aldrich #856177 paraquat
Incubator for nematodes AQUALYTIC Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope Olympus SMZ645
Confocal microscope Zeiss AxioObserver Z1 For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope Zeiss AxioImager Z2 For nematodes (step 2)
UV crosslinker Vilber Lourmat BIO-LINK – BLX-E365 UV light source; 356 nm

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check_url/it/56301?article_type=t

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Citazione di questo articolo
Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., Fivenson, E. M., Spangler, R. D., Kerr, J. S., Cordonnier, S. A., Hou, Y., Dombi, E., Kassahun, H., Tavernarakis, N., Poulton, J., Nilsen, H., Bohr, V. A. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (129), e56301, doi:10.3791/56301 (2017).

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