In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos
Summary
Mitophagy, o processo de compensação danificada mitocôndrias, é necessário para a manutenção de saúde e homeostase mitocondrial. Este artigo apresenta alguns dos mitophagy mais recente métodos de deteção em células humanas, Caenorhabditis eleganse os ratos.
Abstract
As mitocôndrias são as potências de células e produzem energia celular na forma de ATP. Disfunção mitocondrial contribui para o envelhecimento biológico e uma grande variedade de doenças, incluindo doenças metabólicas, doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Parkinson (PD) e síndromes de envelhecimento prematuro. Manutenção da saúde mitocondrial depende de biogênese mitocondrial e eficiente apuramento das mitocôndrias disfuncionais através de mitophagy. Métodos experimentais para detectar com precisão a autofagia/mitophagy, especialmente em modelos animais, tem sido um desafio para desenvolver. Recentes progressos no sentido da compreensão dos mecanismos moleculares de mitophagy permitiu o desenvolvimento de técnicas de deteção de novela mitophagy. Aqui, apresentamos várias técnicas versátil para monitorar mitophagy em células humanas, Caenorhabditis elegans (por exemplo, Rosella e estirpes DCT-1 / IgG-1) e os ratos (mt-Keima). Uma combinação destas técnicas de deteção de mitophagy, incluindo a avaliação entre espécies, irá melhorar a precisão das medições mitophagy e levar a uma melhor compreensão do papel do mitophagy na saúde e na doença.
Introduction
Mitophagy é essencial para a manutenção mitocondrial. Mitocôndria celular múltiplas vias de sinalização se cruzam e é organelas celulares sub universais responsáveis pela produção de energia celular, metabolismo celular e cálcio homeostase1,2,3, 4. as mitocôndrias constantemente experimentam desafios de fontes endógenas e exógenas, como espécies reativas de oxigênio (ROS) e tóxicos mitocondriais, respectivamente, que levam à geração de mitocôndrias disfuncionais e “envelhecidas”. Acúmulo de mitocôndrias danificadas diminui a eficiência da produção de ATP, enquanto aumenta a quantidade de ROS prejudiciais e tem sido associado a doenças relacionadas com a idade, como doenças metabólicas, AD e PD1,5,6 . Para evitar a disfunção celular mitocôndria induzida, necessidade de células especificamente reconhecer danificado mitocôndrias e eficientemente removê-los através de um processo celular denominado autofagia mitocondrial (mitophagy). Isto demonstrou a importância da mitophagy em saúde e doença ilustra a necessidade de métodos precisos e eficientes detectar mitophagy tanto in vitro e in vivo.
Mitophagy é um processo de várias etapas que envolvem muitas proteínas e complexos de proteína a5,7,8. Em breve, uma mitocôndria danificada primeiro é reconhecida e tragada por um phagophore double-membraned, que pode se originam da membrana plasmática, retículo endoplasmático, complexo de Golgi, núcleo ou mitocôndria em si9,10. O esférico phagophore alonga e eventualmente lacra as mitocôndrias no interior, que constitui o autophagosome mitocondrial (mitophagosome). O mitophagosome então se funde com o lisossomo para degradação, formando um autolysosome em que a mitocôndria danificada é degradadas e reciclados7,8. Principais proteínas autophagic também envolvidas em mitophagy incluem: autofagia relacionados 7 (ATG7) e Beclin1 (iniciação), proteína Microtubule-Associated 1A/1B-luz corrente 3 (LC3-II) (LGG-1 em c. elegans) e p62 (componentes do phagophore), e glicoproteína de membrana lisossomal-associado 2 (luz2)6,7. Além disso, há várias proteínas essenciais exclusivos para mitophagy, incluindo induzida por PTEN putativo quinase 1 (rosa-1), proteína Nuclear de ponto 52 kDa (NDP52), Parkin1, optineurin, BCL2 interagindo proteína 3 como (NIX/BNIP3L) (DCT-1 em c. elegans), entre outros5,6,11.
Um método comum para detectar mudanças nos níveis de autofagia é pela relação de LC3-II/LC3-I ou II/LC3-actínio. No entanto, esse método é inespecífico, como um aumento desta relação pode refletir uma iniciação maior ou uma fusão prejudicada de mitophagosome a lisossoma12. Outro método consiste em avaliar o colocalization entre um marcador de autofagia (por exemplo, LC3) e uma proteína mitocondrial (por exemplo, Translocase de exterior mitocondrial membrana 20 (TOMM20, que pode ser degradado por proteasomes)). No entanto, isto só pode indicar alterações nos níveis de mitophagy total e não consegue distinguir da execução no qual bloqueio ocorre. Isso pode ser esclarecido usando inibidores dos lisossomos (por exemplo, A E64d + Pepstatin, denominado EP) em paralelo para causar o acúmulo de mitophagosomes. A diferença entre o número de mitophagosomes na linha de base e o número de mitophagosomes após o tratamento com EP pode indicar mitophagy. Estas limitações têm solicitado o desenvolvimento de técnicas de deteção de novela mitophagy. Tendo em conta a crescente relevância da mitophagy em um amplo espectro de doenças humanas, apresentamos várias técnicas de deteção de mitophagy robusta que podem ser útil para pesquisadores. Podemos cobrir técnicas tanto in vitro e in vivo e recomenda combinar várias técnicas para verificar alterações de mitophagy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medição de mitophagy é tecnicamente exigente. Aqui, apresentamos várias técnicas robustas que permitem ambos detecção qualitativa de mitophagy e quantificação dos níveis de mitophagy nos modelos experimentais de laboratório mais comuns.
Para adquirir dados replicáveis, um projeto experimental com pelo menos três repetições biológicas é necessário. Todos os pesquisadores envolvidos em experimentação e análise devem ficar cego para identidades de grupo experimental. Além di…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Podemos agradecer ao Dr. Atsushi Miyawaki e Dr. Richard J. Youle o plasmídeo mt-Keima e mt-Keima integrado as células Hela. Agradecemos a Raghavendra A. Shamanna e Dr. Deborah L. Croteau para a leitura crítica do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa Intramural de NIH (VAB), o Instituto Nacional sobre envelhecimento, bem como um 2014-2015 e 2016-2017 NIA intralaboratório concedem (FEP, VAB). FEP foi apoiado por HELSE SOR-OST RHF (projeto n: 2017056) e o Conselho de pesquisa da Noruega (projeto n: 262175).
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR:
FEP projetado o manuscrito e elaborou o projecto; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH e ED escreveram seções diferentes do papel; NT, JP, HN e VAB revisto o manuscrito e fornecido a perícia.
Materials
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
Riferimenti
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
- Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
- Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer’s disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2012).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
- Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
- Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).
