Analysen for Transposase tilgjengelig Chromatin kombinert med høy gjennomstrømming sekvensering (ATAC-seq) er en genomet-bred å avdekke tilgjengelig chromatin. Dette er en trinnvis ATAC-seq-protokollen fra molekylær til den endelige beregningsorientert analysen, optimalisert for menneskelig lymfocytter (Th1/Th2). Denne protokollen kan vedtas av forskere uten tidligere erfaring i neste generasjons sekvensering metoder.
Analysen for Transposase tilgjengelig Chromatin med høy gjennomstrømming sekvensering (ATAC-seq) er en metode som brukes til å identifisere åpne (tilgjengelig) regioner i chromatin. Disse regionene representerer regulatoriske DNA elementer (f.eks, arrangører, enhancers, locus kontroll områder, isolatorer) til hvilke transkripsjon faktorer binde. Kartlegging tilgjengelig chromatin landskapet er en kraftig metode for avdekke aktive regulatoriske elementer over genomet. Denne informasjonen fungerer som en upartisk metode for nettverket av relevante transkripsjonsfaktorer og mekanismer for chromatin struktur som styrer gene expression programmer. ATAC-seq er et robust og sensitive alternativ til DNase jeg overfølsomhet analyse kombinert med neste generasjons sekvensering (DNase-seq) og formaldehyd-assistert isolering av regulatoriske elementer (FAIRE-seq) for genomet-omfattende analyse av chromatin tilgjengelighet og sekvensering av micrococcal nuclease-sensitive områder (MNase-seq) til å angi nucleosome plassering. Vi presenterer en detaljert ATAC-seq protokollen optimert for menneskelig primære immunceller dvs CD4 + lymfocytter (T helper 1 (Th1) og Th2 celler). Denne omfattende protokollen begynner med cellen harvest, så beskriver molekylær prosedyren for chromatin tagmentation, prøve forberedelse til neste generasjons sekvensering, og inneholder også metoder og betraktninger om beregningsformelen analyser til Tolk resultatene. Videre, for å spare tid og penger, vi introdusert kvalitetskontroll tiltak for å vurdere ATAC-seq biblioteket før sekvensering. Viktigere, tillater prinsippene i denne protokollen tilpasningen til andre menneskelige immunforsvar og ikke-immune primære celler og linjer. Disse retningslinjene vil også være nyttig for laboratorier som ikke er god med neste generasjons sekvensering metoder.
ATAC-seq1,2 er en robust metode som gjør identifisering av regulatoriske3 åpne chromatin regioner og nucleosome plassering. Denne informasjonen brukes inferring plasseringen, identitet og aktiviteten til transkripsjonsfaktorer. Metodens følsomhet for å måle kvantitative variasjoner i chromatin-strukturen kan studere aktiviteten chromatin faktorer, inkludert chromatin remodelers og modifikatorer, samt transcriptional aktiviteten til RNA polymerase II1. Dermed gir ATAC-seq en kraftig og upartiske tilnærming for å tyde mekanismer som styrer transcriptional regulering i en celle type av interesse. Vi beskriver tilpasningen av ATAC-seq primære menneskelige Th1 og Th2 celler.
I ATAC-seq, hyperaktiv Tn5 transposase lastet med adaptere for neste generasjons sekvensering (NGS) par DNA fragmentering koding av DNA med adaptere (dvs., “tagmentation” prosessen)1. Etter PCR forsterkning er resulterende DNA bibliotekene klar for neste generasjons sekvensering (figur 1). Den privilegerte tagmentation av tilgjengelig chromatin oppdages av analyse av lokale berikelse av ATAC-seq sekvensering.
Den korte eksperimentelle prosedyren og krav for mindre utgangsmaterialet, i forhold til andre metoder for å måle chromatin tilgjengelighet og nucleosomal plassering som DNase-seq4, FAIRE-seq5og MNase-seq6, har fremmet bruken av ATAC-seq i flere biologiske systemer inkludert primær menneskeceller1,7 og klinisk prøver8, samt encellede organismer9, planter10, frukt fluer11 , og ulike pattedyr12.
Identiteten til transkripsjon faktorer som er bundet til tilgjengelig loci kan bli avdekket av analysere anriking av deres bindende sekvens motiver eller kombinere ATAC-seq med chromatin immunoprecipitation (ChIP) etterfulgt av høy gjennomstrømming DNA sekvensering ( ChIP-seq). Denne tilnærmingen aktivert identifikasjon av slektslinje kundespesifikk transkripsjonsfaktorer viktig for hematopoiesis i musen13. Objektivt og globale natur ATAC-seq kan studere genet regulering i organismer som reagenser som antistoffer for ChIP analyse ikke er tilgjengelige. For eksempel evolusjonære variasjoner i cis-regulatoriske regioner har blitt identifisert ved å studere skallen neural crest celler fra mennesker og sjimpanser14, utviklingsmessige variasjoner i regulatoriske elementer under tidlig musen embryogenesis15, endringer i det regulatoriske landskapet under en livssyklus av encellede C. owzarzaki9og utviklingen av arrangørene og enhancers over 20 pattedyr arter12.
ATAC-seq har også vært medvirkende for å måle chromatin tilgjengelighet i enkeltceller, dermed avslørende variasjon i celle populasjoner, som vanligvis omgår genomet hele studier7,16. I tillegg kan ATAC-seq brukes å studere endringene som skjer i DNA regulatoriske regioner i sykdomstilstander, som eksempler er sjeldne. For eksempel ATAC-seq kan brukes til å studere endringer i det regulatoriske landskapet under utbruddet av akutt myelogen leukemi (AML)17 eller Ras-drevet oncogenesis11.
ATAC-seq protokollen beskrevet her har vært vellykket ansatt for analyse av tilgjengelige chromatin i primære celler (menneskelige Th1, Th2 celler og B-celler) og de kultiverte cellelinjer (MCF10A menneskelige brystkreft celler og U261 glioblastom celler). Bruke ATAC-seq andre celletyper kan kreve noen protokollen optimalisering, spesielt i lyse trinn. Hvis konsentrasjonen av ikke-ioniske vaskemiddel er for høy, kan det være en høyere prosentandel av Mitokondrielt DNA forurensning. Dette kan reduseres ved å reduser…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av Israel Science Foundation (grant 748/14), Marie Curie integrering gi (CIG) – FP7-folk-20013-CIG-618763 og jeg-kjernen Program for planlegging og budsjettering komiteen og The Israel Science Foundation gir nei 41/11.
50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
Primer name and sequence | Company | ||
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |