Asignación de genoma cromatina accesible en linfocitos T humanos primarios por ATAC-Seq
Summary
Ensayo para cromatina transposasa accesible junto con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es un método de genoma cromatina accesible de descubrir. Se trata de un protocolo de ATAC-seq paso a paso, desde el molecular al final análisis computacional, optimizado para los linfocitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo puede ser adoptada por los investigadores sin experiencia previa en métodos de secuenciación de próxima generación.
Abstract
Ensayo de cromatina transposasa accesible con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es un método utilizado para la identificación de regiones (accesibles) abiertas de la cromatina. Estas regiones representan ADN elementos reguladores (por ejemplo, promotores, potenciadores, locus control regiones, aisladores) a que transcripción factores unen. Cartografía del paisaje de la cromatina accesible es un enfoque poderoso para descubrir elementos reguladores activos en todo el genoma. Esta información sirve como un enfoque imparcial para descubrir la red de factores de transcripción relevantes y mecanismos de la estructura de la cromatina que regulan programas de expresión génica. ATAC-seq es una alternativa robusta y sensible a la ADNasa I Análisis de hipersensibilidad junto con la secuenciación de próxima generación (DNasa-seq) y asistido por el formaldehído aislamiento de elementos reguladores (FAIRE-seq) para el análisis del genoma de la cromatina accesibilidad y a la secuenciación de sitios sensibles a la nucleasa micrococcal (MNase-seq) para determinar el posicionamiento del nucleosoma. Presentamos un protocolo detallado de ATAC-seq optimizado para humano inmune primario de las células por ejemplo CD4 + linfocitos (helper T 1 (Th1) y las células Th2). Este protocolo integral comienza con la cosecha de la célula, luego describe el procedimiento molecular de la cromatina tagmentation, preparación de muestras para secuenciación de próxima generación y también incluye métodos y consideraciones para el análisis computacional utilizado para interpretar los resultados. Además, para ahorrar tiempo y dinero, introducido medidas de control de calidad para evaluar la biblioteca ATAC-seq antes de la secuencia. Lo importante, los principios presentados en este protocolo permiten su adaptación a otros las células humanas inmunes y no inmunes primarios y líneas celulares. Estas pautas también será útiles para laboratorios que no son expertos en métodos de secuenciación de próxima generación.
Introduction
ATAC-seq1,2 es un método robusto que permite la identificación del regulador3 regiones de cromatina abierta y posicionamiento de nucleosoma. Esta información se aplica para inferir la ubicación, identidad y actividad de factores de transcripción. Sensibilidad del método para la medición de las variaciones cuantitativas en la estructura de la cromatina permite el estudio de la actividad de factores de la cromatina, remodeladores de cromatina y modificadores, así como la actividad transcripcional del RNA polimerasa II1. Así ATAC-seq proporciona un enfoque imparcial y poderoso para descifrar los mecanismos que rigen la regulación transcripcional en cualquier tipo de célula de interés. Se describe la adaptación de ATAC-seq a células Th1 y Th2 humanas primarias.
En ATAC-seq, hiperactiva Tn5 transposasa cargado con adaptadores para secuenciación de próxima generación (NGS) parejas fragmentación del ADN con el marcaje de ADN con adaptadores (es decir, el proceso de “tagmentation”)1. Tras amplificación por PCR, las bibliotecas de ADN resultantes están listas para secuenciación de próxima generación (figura 1). El tagmentation preferencial de la cromatina accesible es detectado por el análisis del enriquecimiento local de Lee de la secuencia seq ATAC.
El procedimiento experimental corto y el requisito de menos material de partida, en comparación con otros métodos para medir la accesibilidad de la cromatina y posicionamiento nucleosomal como DNasa-seq4, FAIRE-seq5y MNase-seq6, ha promovió el uso de ATAC-seq en varios sistemas biológicos como células primarias humanas1,7 y8de las muestras clínicas, así como organismos unicelulares9, plantas10, moscas de la fruta11 y varios mamíferos12.
La identidad de la transcripción de factores que están limitados a lugares accesibles pueden ser descubiertos por analizar el enriquecimiento de sus motivos de secuencia de unión o combinación de ATAC-seq con inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) seguida de alto rendimiento (de secuenciación de ADN ChIP-seq). Este enfoque permitió la identificación de factores de transcripción específicos del linaje importantes de hematopoyesis en ratón13. El carácter imparcial y global de ATAC-seq permite estudiar la regulación de los genes en organismos que no están disponibles reactivos, tales como anticuerpos para el análisis de la viruta. Por ejemplo, variaciones evolutivas en cis-se han identificado regiones reguladoras mediante el estudio de las células de cresta neural craneal de los seres humanos y los chimpancés14, desarrollo variaciones en elementos reguladores durante temprano ratón embriogénesis de15, cambios en el panorama regulatorio durante un ciclo de vida de unicelulares owzarzaki C.9y la evolución de los promotores y potenciadores en mamíferos 20 especies12.
ATAC-seq también ha sido instrumental para la medición de accesibilidad de la cromatina en las células, así revela la variabilidad dentro de poblaciones celulares, que generalmente evade genoma estudios7,16. Además, ATAC-seq puede utilizarse para estudiar los cambios que se producen en regiones reguladoras de DNA en condiciones de enfermedad, en la cual las muestras son raras. Por ejemplo, ATAC-seq puede utilizarse para estudiar los cambios en el panorama regulatorio durante el inicio de la leucemia mieloide aguda (AML)17 o Ras-conducido de la oncogénesis11.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de ATAC-seq descrito aquí se ha empleado con éxito para el análisis de la cromatina accesible en células primarias (humano Th1, Th2 células y células B) así como las líneas de cultivo de células (células de cáncer de mama humanas MCF10A y células de glioblastoma U261). Aplicación de ATAC-seq a otros tipos celulares puede requerir algunos optimización de protocolo, especialmente en el paso de lisis. Si la concentración de detergente no iónico es demasiado alta, puede haber un porcentaje mayor …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por la Israel Science Foundation (grant 748/14), Marie Curie de integración otorga (CIG) – FP7-gente-20013-CIG-618763 y I-CORE programa de planificación y Comisión de presupuesto y el Israel Science Foundation beca nº 41/11.
Materials
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
Riferimenti
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