Metoder för Imaging intracellulära pH av follikeln Stem Cell härstamning i levande Drosophila äggstocksvävnad
Summary
Vi tillhandahåller ett protokoll för imaging intracellulära pH i en epitelial stamceller härstamning i levande Drosophila äggstocksvävnad. Vi beskriva metoder för att generera transgena flugor uttrycker en pH biosensor, mCherry::pHluorin, bild den biosensor med hjälp av kvantitativa fluorescens imaging, generera standard kurvor och konvertera fluorescens intensitetsvärden till pH-värden.
Abstract
Förändringar i intracellulära pH (pHi) spelar viktiga roller i regleringen av många cellulära funktioner, inklusive metabolism, proliferation och differentiering. Vanligtvis bestäms pHi dynamics i odlade celler, som kan bli föremål för mätning och experimentellt manipulera pHi. Men har den senaste utvecklingen av nya verktyg och metoder gjort det möjligt att studera pHi dynamiken inom intakt, levande vävnad. Drosophila forskning, var en viktig utveckling generationen av en transgen linje som bära en pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Här beskriver vi ett protokoll som använder vi rutinmässigt för imaging levande Drosophila ovarioles att mäta pHi i epitelial follikeln stamceller (FSC) härstamning i mCherry::pHluorin transgena vildtyp linjer; dock kan de metoder som beskrivs här enkelt anpassas för andra vävnader, inklusive wing skivor och ögat epitel. Vi beskriver tekniker för att uttrycka mCherry::pHluorin i FSC härstamning, att upprätthålla äggstocksvävnad under levande imaging, och förvärva och analysera bilder för att få pHi värden.
Introduction
Senare studier visade en roll för förändringar i pHi under cellulär differentiering och dysplasi i vivo1,2. Dessa studier fann att pHi är anmärkningsvärt konsekvent i celler av samma typ i samma skede av differentiering, men att det ändras när celler övergång från ett stadium till ett annat. I vissa fall stör blockerar ändringarna i pHi delvis differentiering, vilket tyder på att förändringen i pHi är inte bara en följd av förändringar i cell öde men istället bidrar till att främja förändringar i cell öde, kanske genom effekter på pH-känsliga rättsliga proteiner eller kemiska reaktioner krävs för differentiering. Framtida studier har potential att avslöja mer inblick i många olika roller pHi dynamics in-vivo. Dock är en av utmaningarna som studerar pHi under differentiering i vivo att erhålla noggranna mätningar av pHi. Till skillnad från andra funktioner av differentiering, såsom förändringar i cellulära morfologi och genuttryck, är pHi en labil kemisk egenskap av cellen som inte bevaras i celler som har fasta och permeabilized med standardmetoder. Dessutom kanske inte pHi stabil i celler som är stressade eller döende experimentella manipulering. Därför är det viktigt att hålla cellerna lever och så frisk som möjligt när man mäter pHi. Det finns flera avgörande färgämnen att fungerar bra för mätning av pHi av celler i kultur3, men i många fall de inte är lämpliga för i vivo studier eftersom de inte tränga vävnad djupt eller jämnt nog att ge noggranna mätningar .
För att kringgå problemet med dålig dye penetration, har vi och andra använt en genetiskt kodade sond, mCherry::pHluorin4,5,6,7, som kan uttryckas specifikt i cellen typer av intresse och avbildad i levande vävnad. pHluorin är en variant av GFP med en högre pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0) som fälls lättare vid högre pH; så totalt fluorescensintensiteten som avges från en population av pHluorin molekyler i cellen ökar med ökande pHi8. Viktigt, är fluorescens linjär inom det normala cytosoliska pHi värdeintervallet. I kontrast, fluorescensen av mCherry (pKa ~ 4.5) är okänslig mot pH-förändringar inom intervallet cytosoliska. Dessa två reportrar är kovalent kopplade tillsammans som ett enda chimära protein, kodas av en enda öppen behandling ram, så de är alltid närvarande i lika mängder. Förhållandet mellan pHluorin till mCherry fluorescensintensiteten ger därför en mätning av pHi som är normaliserad till koncentrationen av sonden i varje cell. Nyckeltalen kan sedan konverteras till uppskattningar av pHi värden använder en standardkurva som genereras genom att skaffa pHluorin till mCherry nyckeltal från vävnader som har varit utjämnad till kända pH-värden.
Här beskriver vi metoderna för att mäta pHi av epitelial FSC härstamning i Drosophila äggstockarna med mCherry::pHluorin. Denna välkarakteriserad vävnad har använts för att modellera många olika aspekter av epitelial biologi, såsom stamceller självförnyelse och differentiering9,10,11, kollektiva cellmigration12 , samt utveckling och underhåll av cell polaritet13,14. Follikeln epitelet är producerad av två Scheme som bor på den främre kanten av vävnaden i en struktur som kallas de germarium15,16. Dessa celler delar regelbundet under vuxenlivet att själv förnya och producera avkomma, kallas prefollicle celler (PFC), som kan antingen ange nischen och bli en FSC eller differentieras till en av tre olika follikeln celltyper: polar celler, stjälk-celler, eller huvuddel follikeln celler. Vi visade tidigare som vildtyp vävnad, pHi ökar stadigt under de tidiga stadierna av differentiering, från en pHi på cirka 6,8 i Scheme till 7.0 i PFC, till 7,3 i follikeln celler2. Blockerar denna ökning av RNAi Nedslagning av en ubiquitously uttryckt natrium/proton växlare, DNhe2, allvarligt försämrar pFC differentiering, ökar pHi av överuttryck av DNhe2 orsakar en mild överskott differentiering fenotyp. Dessa resultat visar att pHi bibehålls stabilt i den tidiga FSC härstamning och att det kan vara experimentellt ökat eller minskat i vivo. Metoderna som beskrivs här kan användas för att mäta pHi i antingen vildtyp vävnad eller olika former av mutanter vävnader, inklusive RNAi knockdown eller överuttryck använder en Gal4 av intresse och mitotiska kloner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, beskriver vi en metod för mätning av pHi av celler i FSC härstamning inom vildtyp vävnad. Detta protokoll har utvecklats och förfinats under de senaste fem åren, sedan vi först började studera pHi i Drosophila äggstocksvävnad. Under den tiden, har protokollet använts framgångsrikt av flera utredare i vårt labb och på minst fyra olika snurrande skiva och laserscanning Mikroskop. Reproducerbarheten för vår ursprungliga observation, att pHi ökar som celler i FSC släktlinje skilja från stamc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Bryne Ulmschneider för bidrag till protokollet och Diane Barber för förslag på manuskriptet. Detta arbete finansierades av ett nationellt institut för hälsa grant GM116384 T.G. Nystul och D.L. frisör.
Materials
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
| y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and mounting tools | |||
| 2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
| Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
| Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |
Riferimenti
- Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
- Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
- Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
- Choi, C. -. H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric imaging of pH probes. Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
- St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141 (5), 757-774 (2010).
- Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
- Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).
- Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).
