В пробирке Фагоцитоз миелина мусора макрофагами, костного мозга, полученных
Summary
Мы представляем методы для оценки фагоцитарной способности первичного мышиных костного мозга, полученных макрофагов с использованием мусора дневно обозначенные миелина и внутриклеточных липидов капелька пятнать.
Abstract
Костный мозг производные макрофагов (BMDMs) являются зрелых лейкоцитов, которые служат критических Физиологическая роль как профессиональные фагоциты способны очистки различных частиц. Как правило BMDMs ограничены от центральной нервной системы (ЦНС), но после травмы, они могут легко проникнуть. Однажды в пораженных тканей ЦНС, BMDMs являются главной ячейки тип ответственность за разминирование травмы производные сотовой мусора, включая большое количество липидов богатых миелина мусора. Патологического последствия BMDM инфильтрации и миелина мусора фагоцитоза в пределах центральной нервной системы являются сложными и не хорошо понятны. Протоколы, описанные здесь, позволяют для прямой в vitro исследования BMDMs в контексте травмы ЦНС. Мы покрываем мышиных BMDM изоляции и культуры, миелина мусора подготовки и анализов для оценки BMDM миелина мусора фагоцитоза. Эти методы производить надежные количественные результаты без необходимости значительного специализированного оборудования или материалов, но могут быть легко настроены для удовлетворения потребностей исследователей.
Introduction
Костный мозг производные макрофагов (BMDMs) являются важным связующим звеном между врожденная и адаптивного иммунитета. Как антиген представляющих клеток (БТР) они могут общаться с лимфоцитов через обе презентации антигена и цитокина релиз1,2,3. Однако как профессиональных фагоцитов, их основная функция – очистить патогенов, возрасте клеток и клеточных обломков1,4. После травмы спинного мозга (SCI) значительное количество миелина мусора генерируется из умирающих олигодендроциты, типа клеток, ответственных за ЦНС аксона миелинизации5. Мы и другие показали, что распродажа миелина мусора является прежде всего обязанностью проникновения BMDMs5,6,7. Однако в пределах спинного сайты сплошным миелина мусора было предложено перенести эти обычно противовоспалительных клеток к про воспалительных государство5,8,9. Как основные посредники нейро-воспаления спинного мозга пострадавшего BMDMs являются важные клинические цели.
Чтобы помочь изучить влияние BMDMs в спинной мозг потерпевшего, мы разработали модель в vitro непосредственно изучить, как BMDMs реагировать миелина мусора. Для улучшения биологической значимости, первичный мышиных BMDMs и свежевыделенных миелина мусора используются в этих расследований. Таким образом представленные здесь методы также подробно изоляции и культуры первичной мышиных BMDMs, и изменение сахарозы градиентный метод, используемый для изолировать мышиных ЦНС производных миелина мусора10,,1112. Миелиновые мусора могут быть легко помечены Люминесцентную краску, Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE), трек, который его интернализации, BMDMs. CFSE хорошо подходит для этого приложения, потому что это не цитотоксических, и разрешений на его узких флуоресцентного спектра мультиплексирование с другими флуоресцентных зондов13,14. После фагоцитоза миелина мусора липиды транспортируются через лизосом и упакованы как нейтральные липиды в внутриклеточного липидного капель5. Для количественного определения это накопление внутриклеточных липидов, мы представляем O Красного масла (Оро), окрашивание метод, оптимизированный для анализа количественных изображений. Этот простой метод окрашивания производит надежные воспроизводимость результатов и количественной оценки15. Эти методы содействия изучению миелина мусора фагоцитоза и липидов удержания с ограниченным специализированного оборудования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процедуры, описанные здесь используют свежевыделенных сырой ЦНС миелина мусора и первичного костного мозга-производные макрофагов. Чтобы уменьшить расходы животных, мы рекомендуем, чтобы оба мозги и клеток костного мозга быть заготавливаемым от каждой мыши во время жертвоприношения….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Сэнгер Гленн-Ходжсон, специалист по СМИ в БСС колледж медицины для всех его работу в видео, редактирования и голос за кадром.
Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (R01GM100474 и R01GM072611).
Materials
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | 30-002-CI | 100X Solution |
| New Born Calf Serum (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | United States Origin |
| NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] | ATCC | CCL-1 | L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation |
| 24-well Cell Culture Plates | VWR | 10062-896 | |
| Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
| CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher | C34570 | DMSO for Reconsitution Provided |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-11 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Equipment | |||
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium |
| Hand Held Rotary Homogenizer | Fisher Science | 08-451-71 |
Riferimenti
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
- Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
- Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
- Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
- Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
- Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
- Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
- Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
- Larocca, J. N., Norton, W. T. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
- Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
- Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
- Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
- Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
- Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
- Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
- Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
