Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade
Summary
Descrevemos aqui um ensaio livre celular bioquímico fluorométrica para determinação da peroxidação lipídica-HDL. Este ensaio rápido e reprodutível pode ser usado para determinar a função do HDL em estudos de grande escala e pode contribuir para nossa compreensão da função do HDL em doenças humanas.
Abstract
Os níveis de colesterol (HDL-C) baixa lipoproteína de alta densidade são um dos mais poderosos preditores independentes de negativos de doença cardiovascular aterosclerótica (CVD). A estrutura e a função do HDL, ao invés de HDL-C podem prever com mais precisão a aterosclerose. Ocorrem vários HDL proteínas e lipídios composicionais alterações que prejudicam a função do HDL em Estados inflamatórios como a aterosclerose. Função do HDL é geralmente determinada por célula com base em ensaios como ensaio de efluxo de colesterol mas estes ensaios tem numerosos de inconvenientes de falta de padronização. Ensaios sem célula podem dar mais eficázes de função de HDL em comparação com ensaios cell-based. Oxidação de HDL prejudica a função do HDL. HDL tem um papel importante no transporte de peróxidos lipídicos e alta quantidade de peróxidos lipídicos está relacionada com função anormal do HDL. Interações lipid-sonda devem ser consideradas quando a interpretação dos resultados de fluorescência não enzimáticos ensaios para medir o estado oxidativo de lipídios. Isto motivou-na desenvolver um método enzimático bioquímico celular livre para avaliar HDL peróxido teor lipídico (HDLox) que contribui para a disfunção de HDL. Este método baseia-se a enzima peroxidase de rábano (HRP) e o fluorocromo vermelho Amplex que pode quantificar (sem oxidase de colesterol), o teor de peróxido lipídico por mg de HDL-C. Eis um protocolo describedfor determinação da peroxidação lipídica HDL usando o reagente de fluorocromo. Variabilidade do ensaio pode ser reduzida pela padronização rigorosa das condições experimentais. Valores mais altos de HDLox estão associados com a função de antioxidante HDL reduzida. A leitura deste teste é associada com leituras de ensaios cell-based validados, medidas de substituto de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune e fenótipos associados risco cardiovascular e metabólico. Esta abordagem técnica é um método robusto para avaliar a função do HDL em doenças humanas, onde a inflamação sistêmica, estresse oxidativo e lipídios oxidados têm um papel fundamental (tais como a aterosclerose).
Introduction
Doença cardiovascular aterosclerótica (DCV) é a principal causa de morte em todo o mundo1,2. Estudos epidemiológicos têm demonstrado que baixos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) colesterol geralmente estão inversamente associados com o risco para o desenvolvimento da aterosclerose1,2. Embora diversos estudos apoiam um papel atheroprotective para HDL1,2, o mecanismo pelo qual o HDL atenua o início e progressão da aterosclerose é complexo 3,4. Assim, tem sido sugerido que a complexa estrutura e função do HDL, ao invés de nível absoluto podem prever com mais precisão aterosclerose 5,6,7,8. Ocorrem vários HDL proteínas e lipídios composicionais alterações que prejudicam a função do HDL em Estados inflamatórios como a aterosclerose. Estes i) reduzir seu potencial de efluxo de colesterol 9, ii) diminuir anti-inflamatório e aumento de HDL-associado a proteínas pró-inflamatórias 6,7, iii) diminuição fator os níveis de antioxidantes e atividade e HDLs capacidade de inibir a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDLox)10 e iv) aumentar lipídico hidroperóxido conteúdo e redox atividade (HDLox)9,11. Robustos ensaios que avaliam as funções de pleotropic de HDL (tais como o efluxo de colesterol, função antioxidante) podem complementar a determinação de HDL-HDL-C, na clínica.
Função do HDL é geralmente avaliada por métodos baseados em células, tais como o colesterol efluxo ensaio8,12,13,14. Esses métodos têm limitações principais incluindo heterogeneidade significativa em relação a tipos de células utilizadas, tipo de leitura relatado, a falta de padronização e confundimento efeitos de triglicerídeos 7,15. Estas desvantagens apresentam dificuldades para grandes estudos clínicos16. Ensaios sem célula podem dar mais eficázes de função de HDL em comparação com ensaios cell-based. O efluxo de colesterol é uma das mais importantes funções de HDL, mas isso só pode ser determinado por ensaios cell-based. Outras abordagens para determinar a função do HDL como proteomics17,18,19,20,21,22,23, 24 e ensaios de quimiotaxia de monócitos baseada em célula de HDL função 17,22,25 não tem sido padronizados e não pode ser usados em estudos humanos em grande escala.
HDL tem antioxidante significativa atheroprotective efeito5,6,7,8. Determinou-se a função antioxidante de HDL na presença de LDL anterior célula livre ensaios fluorométrica 26. Estes métodos bioquímicos fluorométrica de função antioxidante de HDL foram originalmente desenvolvidos por Mohamad Navab e Alan Fogelman e seus colegas26. Embora muitos estudos humanos usaram estes métodos para determinar o HDL função 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lipídios (HDL)-lipídeos (LDL) e interações lipid-fluorocromo podem limitar a reprodutibilidade destes celular grátis não enzimáticos bioquímicos ensaios de HDL função27,28.
Recente interesse centrou-se sobre as consequências funcionais da oxidação de HDL que é o resultado da oxidação de lipídios e proteínas dentro de HDL 27,29,30. Estudos prévios mostraram que oxidação de HDL prejudica HDL função 27,29,30. HDL tem um papel importante no transporte de peróxidos lipídicos e alta quantidade de peróxidos lipídicos está relacionada com função anormal do HDL. Assim, teor de peróxido lipídico HDL pode ser usado para determinar o HDL função 9,17,20,31 e dada as limitações conhecidas dos ensaios prévios de HDL função7, de27,de 15,32, desenvolvemos um método alternativo de fluorométrica que quantifica o HDL lipid índice de peróxido (HDLox) 32. Este método baseia-se a enzima peroxidase de rábano (HRP) e o fluorocromo vermelho Amplex que pode quantificar (sem oxidase de colesterol), o teor de peróxido lipídico por mg de HDL-C 32. O princípio bioquímico do ensaio é mostrado na Figura 1. Mostramos que essa abordagem baseada em fluorescência não tem as limitações de prévia HDL função ensaios27,28. Este ensaio tem sido ainda mais refinado e padronizado em nosso laboratório para que confiável pode ser usada em estudos humanos em grande escala, mesmo com criopreservado plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. a leitura deste teste é associada com leituras de ensaios cell-based validados, medidas de substituto de doenças cardiovasculares, inflamação sistêmica, disfunção imune e risco cardiovascular e metabólico associado fenótipos 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. aqui, descrevemos este método simples, porém robusto para medir o teor de peróxido do lipídico HDL (HDLox). Este ensaio pode ser usado como uma ferramenta para responder perguntas de pesquisas importantes sobre o papel da função de HDL em doenças humanas onde a inflamação sistêmica, estresse oxidativo e lipídios oxidados têm um papel-chave (tais como aterosclerose)32.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui oferece uma ferramenta robusta para responder perguntas importantes pesquisas sobre o papel da função de HDL em aterosclerose e doenças humanas. O ensaio quantifica o teor de peróxido lipídico HDL por mg de HDL-C usando amplificação enzimática (HRP). Essa abordagem evita as limitações conhecidas dos ensaios de função prévias HDL (por exemplo, o ensaio de efluxo de colesterol) incluindo a heterogeneidade significativa em relação a tipos de células utilizadas, tipo de leitura que r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores, com gratidão, reconhecer o trabalho do Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman e Srinivasa Reddy para seu papel-chave no desenvolvimento de iterações anteriores deste modelo. T.A.A. é suportado por um RMIT University Vice-Chanceler do Postdoctoral Fellowship. AJ e AH são suportados por NHMRC projeto grant 1108792. TK é suportado pelo NIH concede NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124.
Materials
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387–955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
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