Il dosaggio di ricostituzione di Organoid (ORA) per l'analisi funzionale di nicchia cellule staminali intestinale e
Summary
Organoid intestinale culture sono stabilite da cripte interi e non consentono l’analisi di auto-rinnovamento e differenziazione in modo specifico delle cellule. Questo protocollo descrive la ricostituzione del gambo ordinato (Lgr5+) e cellule (Paneth), che danno luogo a organoids consentendo loro previa modificazione biochimica e genetica e analisi funzionale di nicchia.
Abstract
L’epitelio intestinale è caratterizzata da un tasso di turnover estremamente rapida. Nei mammiferi, l’intero rivestimento epiteliale si rinnova entro 4-5 giorni. Le cellule staminali adulte intestinale risiedono nella parte inferiore delle cripte di Lieberkühn, sono state stanziate dall’espressione del gene Lgr5 e preservare l’omeostasi attraverso loro caratteristico alto tasso proliferativo1. In tutto l’intestino tenue, Lgr5+ cellule staminali sono mescolareate con le cellule secretorie specializzate chiamate cellule di Paneth. Cellule di Paneth secernono composti antibatterici (cioè, il lisozima e cryptdins/defensine) ed esercitano un ruolo di controllo sulla flora intestinale. Più recentemente, una funzione di romanzo è stato scoperto per cellule di Paneth, vale a dire la loro capacità di fornire supporto di nicchia di cellule staminali Lgr5+ attraverso diversi ligandi chiave come Wnt3, EGF e Dll12.
Quando isolato ex vivo e coltivate in presenza di specifici fattori di crescita e di componenti della matrice extracellulare, cripte intestinali intero danno luogo a longevo e autorinnovanti strutture 3D chiamato organoids che ricordano molto il cripta-villo architettura epiteliale del piccolo intestino adulto3. Organoid culture, quando stabilito da tutta cripte, consentono lo studio di auto-rinnovamento e differenziazione della nicchia staminale intestinale, senza però affrontare il contributo dei suoi singoli componenti, vale a dire la Lgr5+ e Cellule di Paneth.
Qui, descriviamo un nuovo approccio per il dosaggio di organoid che sfrutta la capacità di Paneth e Lgr5+ cellule per associare e formare organoids quando co-coltivate. Questo approccio, definito come “dosaggio di ricostituzione organoid” (ORA), consente la modifica genetica e biochimica di Paneth o Lgr5+ cellule staminali, seguite da ricostituzione in organoids. Come tale, consente l’analisi funzionale dei due principali componenti della nicchia staminale intestinale.
Introduction
L’epitelio intestinale è il tessuto più rapida auto-propagarsi nel corpo dei mammiferi e, come tale, è stato oggetto di una pletora di studi finalizzati alla identificazione e caratterizzazione funzionale delle cellule staminali adulte che risiedono nella parte inferiore della cripta di Lieberkühn, stanziato dall’espressione del gene di Lgr5 e dalla canonica Wnt segnali1. In particolare, le cellule staminali Lgr5+ sono affiancate e supportate da cellule specializzate di nicchia, cioè cellule di Paneth, che dipendono anche dalla segnalazione di Wnt per loro maturazione2. Insieme, questi due tipi di cellule sono alla base di auto-rinnovamento del rivestimento epiteliale intestinale e preservare l’equilibrio omeostatico giornaliero: Lgr5+ cellule staminali rapidamente dividersi e dare origine a cellule progenitrici e più specializzata intestinale epiteliale cellule; Cellule di Paneth forniscono fattori essenziali di nicchia (ad es., Dll1, Wnt3, EGF) a Lgr5+ 2le cellule staminali. La capacità delle cripte intestinali quando placcato ex vivo per formare le strutture organizzate e autorinnovabile chiamato organoids, o “mini-coraggio”, è stata sfruttata come strumento sperimentale per fornire la comprensione nei processi quali auto-rinnovamento e differenziazione in condizioni normali e patologiche, tra cui cancro4. Organoid culture sono state stabilite da diversi tessuti, tra cui l’intestino, pancreas, fegato e rene, da campioni umani4sia il mouse. Il metodo di estrazione e i fattori di crescita impiegati per sviluppare queste culture organoid sono tessuto-specifici e progettati per guidare la differenziazione multi-lignaggio e imitare quanto più possibile l’originale nicchia staminale in vivo. Organoids possono avere potenziali applicazioni compreso il trattamento di malattie genetiche, la valutazione dell’efficacia terapeutica nel cancro, l’analisi della tossicità della droga o lo studio dell’organogenesi in vitro5.
Nel complesso, la limitazione principale di organoid culture quando stabilito dai campioni di tessuto è una mancanza di specificità delle cellule. Ad esempio, intestinale organoids stabilito da cripte intestinali intero non consentono l’analisi dei singoli componenti cellulari, incluso all’interno dell’origine del tessuto (ad esempio, contengono cripte tutta Lgr5+, Paneth, e cellule progenitrici).
Qui, descriviamo un metodo novello, indicato come ORA, che unisce i vantaggi delle culture organoid intestinale con l’analisi funzionale delle sue componenti fondamentali, vale a dire (Lgr5+) cellule staminali e nicchia (Paneth). Ciò si realizza attraverso la capacità unica di Paneth e Lgr5+ cellule per associare fisicamente a vicenda quando co-incubate e danno luogo a organoids2,6,10. Abbiamo approfittato di questa funzionalità e pre-trattati singolarmente i due tipi cellulari prima di consentire loro di ricostituire organoids. In tal caso, ciascun componente delle cellule possa essere esposti a qualsiasi dato farmaco, fattore di crescita, biochimici inibitore, modificazione genetica o trattamento chimico prima della ricostituzione e formazione organoid. Quindi, usando l’analisi ORA permetterà la determinazione di se un trattamento specifico o la modificazione genetica ha un effetto specifico sulle cellule staminali o loro controparte di nicchia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le ORA permette la raffinata analisi funzionale dei due componenti essenziali della nicchia staminale intestinale, vale a dire Lgr5+ e cellule di Paneth. Questo approccio è stato impiegato in precedenza da noi e gli altri con lievi modifiche6,10,11. Qui, presentiamo la procedura ORA come un protocollo di laboratorio riproducibile e standardizzato. Inoltre, segnaliamo sugli effetti dell’Apc downregul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato reso possibile dai finanziamenti dalla Dutch Cancer Society (KWF; EMCR 2012-5473) e il World Cancer Research fondi International (WCRF; progetto n. 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
Riferimenti
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
