De Organoid reconstitutie Assay (ORA) voor de functionele analyse van intestinale stam en Niche cellen
Summary
Intestinale organoid culturen van hele crypten gevestigd zijn en laat niet de analyse van zelf-vernieuwing en differentiatie in een cel-specifieke mode. Dit protocol beschrijft reconstitutie van gesorteerde stengel (Lgr5+) en niche (Paneth) cellen, die aanleiding tot organoids geven terwijl het toelaten van hun voorafgaande biochemische en genetische modificatie en de functionaalanalyse.
Abstract
Het intestinaal epitheel wordt gekenmerkt door een zeer snelle Verwerkingsfrequentie. Bij zoogdieren, wordt de gehele epitheliale bekleding vernieuwd binnen 4-5 dagen. Volwassen intestinale stamcellen bevinden zich aan de onderkant van de crypten van Lieberkühn, door de expressie van het Lgr5 -gen zijn bestemd en homeostase via hun karakteristieke proliferatieve hoog1behouden. In de dunne darm, Lgr5+ stamcellen zijn vermengd met gespecialiseerde secretoire cellen genaamd Paneth cellen. Paneth cellen afscheiden van antibacteriële stoffen (d.w.z., lysozym en cryptdins/defensinen) en het uitoefenen van een controlerende rol op de darmflora. Meer onlangs, is een nieuwe functie voor Paneth cellen, namelijk hun capaciteit niche steun bieden aan de cellen van de stam van Lgr5+ door middel van verschillende belangrijke liganden zoals Wnt3, EGF en Dll12ontdekt.
Als ex vivo geïsoleerd en in aanwezigheid van bepaalde groeifactoren en componenten van de extracellulaire matrix gekweekt, hele intestinale crypten aanleiding geven tot langlevende en zelf vernieuwen 3D structuren genoemd organoids die sterk lijken op de crypt-villosités epitheliale architectuur van de volwassen dunne darm3. Organoid culturen, als tot stand gebracht van hele crypten, toestaan dat de studie van zelf-vernieuwing en differentiatie van de intestinale stamcel niche, maar zonder een aanpak van de bijdrage van de afzonderlijke onderdelen, namelijk de Lgr5+ en Paneth cellen.
Hier beschrijven we een nieuwe benadering voor de organoid-bepaling die van de mogelijkheid van Paneth profiteert en Lgr5+ cellen vormen van organoids te koppelen wanneer mede gekweekt. Deze aanpak, aangeduid als de “organoid reconstitutie assay” (ORA), kan de genetische en biochemische wijziging van Paneth of Lgr5+ stamcellen, gevolgd door reconstitutie in organoids. Als zodanig, maakt het de functionele analyse van de twee belangrijkste componenten van de intestinale stamcel niche.
Introduction
Het intestinaal epitheel is is het snelst zichzelf vernieuwende weefsel in het lichaam van zoogdieren en, als zodanig, het object van een overvloed aan studies gericht op de identificatie en functionele karakterisering van de volwassen stamcellen, wonende aan de onderkant van de crypte van Lieberkühn, gereserveerde door expressie van het Lgr5 -gen en afhankelijk van de canonieke Wnt signalen1. Met name zijn de cellen van de stam van de Lgr5+ geflankeerd en ondersteund door gespecialiseerde niche cellen, d.w.z. de Paneth cellen, die ook afhankelijk zijn van de Wnt signalering voor hun rijping2. Samen, deze twee celtypes ten grondslag liggen aan de zelf-vernieuwing van de epitheliale darmwand en het dagelijkse homeostatische evenwicht bewaren: Lgr5+ stamcellen snel verdelen en aanleiding geven tot voorlopercellen en meer gespecialiseerde intestinale epithelial cellen; Paneth cellen essentiële niche factoren (bijvoorbeeld, Dll1, Wnt3, EGF) geven Lgr5+ 2van de cellen van de stam. De capaciteit van intestinale crypten wanneer vergulde ex vivo vormen van georganiseerde en zichzelf vernieuwend structuren organoids, of “mini-guts”, genoemd als een experimenteel hulpmiddel om inzicht in processen zoals zelf-vernieuwing is benut en differentiatie in normale en pathologische omstandigheden waaronder kanker4. Organoid culturen zijn verschillende weefsel, met inbegrip van de darm, de alvleesklier, de lever, en de nier, zowel muis als menselijke specimens4vastgesteld. De extractiemethode en de groeifactoren werkzaam te ontwikkelen deze organoid culturen zijn weefsel-specifieke en ontworpen om te rijden meerdere lineage differentiatie en bootsen zo dicht mogelijk de oorspronkelijke cel van de stam-niche in vivo. Organoids wellicht potentiële toepassingen met inbegrip van de behandeling van genetische ziekten, de beoordeling van de therapeutische werking in kanker, de analyse van de drug toxiciteit of de studie van de organogenese in vitro5.
De belangrijkste beperking van organoid culturen als van weefselmonsters tot stand gebracht is over het algemeen een gebrek cel-specificiteit. Bijvoorbeeld, intestinale organoids vastgesteld van hele intestinale crypten niet toestaan de analyse van individuele cellulaire componenten omvatte binnen de bron van het weefsel (bvhele crypten bevatten Lgr5+, Paneth, en voorlopercellen).
Hier beschrijven we een nieuwe methode, hierna aangeduid als ORA, die de voordelen van intestinale organoid culturen met de functionele analyse van de meest fundamentele onderdelen, namelijk stam (Lgr5+) en niche (Paneth) cellen combineert. Dit wordt bereikt door het unieke vermogen van Paneth en Lgr5+ cellen om fysiek te koppelen aan elkaar wanneer mede geïncubeerd en aanleiding tot organoids2,6,10 geven. Wij maakte gebruik van deze functie en vooraf behandeld de twee celtypes individueel alvorens deze te reconstrueren organoids. Daarbij elk onderdeel van de cel kan worden blootgesteld aan bepaalde drug, groeifactor, biochemische remmer, genetische modificatie, of chemische behandeling voorafgaand aan de reconstructie en de vorming van de organoid. Met behulp van de ORA bepaling staat dan ook toe de bepaling van de vraag of een specifieke medicamenteuze behandeling of genetische modificatie een bepaald effect op de cellen van de stam of de wederpartij van hun niche heeft.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ORA kunt de verfijnde functionele analyse van de twee wezenlijke basiscomponenten van de intestinale stamcel niche, namelijk Lgr5+ en Paneth cellen. Deze aanpak heeft eerder gewerkt door ons en anderen met lichte wijzigingen6,10,11. Hier presenteren we de ORA-procedure als een reproduceerbare en gestandaardiseerde laboratorium protocol. Ook wij rapporteren over de gevolgen van Apc Downregulatie in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd mogelijk gemaakt door financiële steun van de Nederlandse Cancer Society (KWF; EMCR 2012-5473) en het wereld kanker onderzoek middelen International (WCRF; project no. 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
Riferimenti
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
