Die organoide Rekonstitution Assay (ORA) für die funktionelle Analyse von intestinale Stammzellen und Nische Zellen
Summary
Intestinale organoide Kulturen werden aus ganzen Krypten und erlauben nicht die Analyse der Selbsterneuerung und Differenzierung in eine Zelle-spezifische Art und Weise. Dieses Protokoll beschreibt Rekonstitution der sortierten Stamm (Lgr5+) und Nische (Paneth) Zellen, die Organellen hervorrufen und ermöglicht ihre vorherige biochemische und genetische Modifikation und Funktionsanalyse.
Abstract
Das Darmepithel zeichnet sich durch eine extrem hohe Fluktuationsrate. Bei Säugetieren ist die gesamte epitheliale Auskleidung innerhalb von 4-5 Tagen erneuert. Intestinaler Stammzellen befinden sich am unteren Rand der Krypten Lieberkühn, sind bestimmt durch die Expression des Lgr5 -Gens und Homöostase durch ihre charakteristische hohe proliferative Rate1erhalten. In den Dünndarm Lgr5+ Stammzellen sind vermischt mit spezialisierten sekretorischen Zellen Paneth-Zellen genannt. Paneth-Zellen sezernieren antibakterielle Verbindungen (d. h., Lysozym und Cryptdins/Defensine) und eine Kontrollfunktion auf die Darmflora ausüben. Vor kurzem wurde eine neue Funktion für Paneth Zellen, nämlich ihre Fähigkeit zur Nische unterstützen Lgr5+ Stammzellen durch mehrere wichtige Liganden Wnt3, EGF und Dll12entdeckt.
Als Ex-Vivo isoliert und in Anwesenheit von bestimmten Wachstumsfaktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix kultiviert, ganze Darm Krypten führen zu langlebigen und selbst erneuern 3D-Strukturen genannt Organellen, die Krypta-Villus sehr ähneln epitheliale Architektur des Erwachsenen Dünndarm3. Organoide Kulturen, wenn hergestellt aus ganzen Krypten, ermöglichen die Untersuchung der Selbsterneuerung und Differenzierung von der intestinalen Stammzellnische allerdings ohne Adressierung des Beitrags der einzelnen Komponenten, nämlich der Lgr5+ und Paneth-Zellen.
Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz zur organoide Assays, die die Fähigkeit der Paneth nutzt und Lgr5+ Zellen verbinden und Organellen bilden wenn Co kultiviert. Dieser Ansatz, hier als “organoide Rekonstitution Assay” bezeichnet (ORA), ermöglicht die genetische und biochemische Änderung Paneth oder Lgr5+ Stammzellen, gefolgt von der Rekonstitution in Organellen. So ermöglicht es die Funktionsanalyse der zwei Hauptkomponenten der intestinalen Stammzellnische.
Introduction
Das Darmepithel ist das am schnellsten selbst erneuernde Gewebe im Säugetier-Körper und als solche wurde das Objekt von einer Vielzahl von Studien, die darauf abzielen, die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von adulten Stammzellen, die ihren Wohnsitz am unteren Rand der Krypta der Lieberkühn, zweckgebundene durch Expression des Lgr5 -Gens und kanonischer Wnt Signale1abhängig. Insbesondere sind Lgr5+ Stammzellen flankiert und unterstützt durch spezielle Nische Zellen, d.h. Paneth-Zellen, die auch abhängig von Wnt signalisieren für ihre Reifung2. Zusammen, diese beiden Zelltypen zugrunde liegen Selbsterneuerung der intestinalen epithelialen Auskleidung und die täglichen homöostatische Gleichgewicht zu bewahren: Lgr5+ Stammzellen schnell teilen und geben Anlass zu Vorläuferzellen und mehr spezialisierte intestinale epitheliale Zellen; Paneth-Zellen liefern wesentliche Nische Faktoren (z. B.Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ Stammzellen-2. Die Kapazität der intestinalen Krypten wenn vergoldet ex Vivo , organisierte und selbst erneuernde Strukturen bilden Organellen oder “Mini-Mut”, genannt wurde als ein experimentelles Werkzeug, um Einblick in Prozesse wie Selbsterneuerung ausgeschöpft und Differenzierung in normalen und pathologischen Bedingungen einschließlich Krebs4. Organoide Kulturen wurden aus mehreren Geweben, einschließlich der Darm, Bauchspeicheldrüse, Leber und Nieren, Maus-und Humanproben4eingerichtet. Der Extraktionsmethode und die Wachstumsfaktoren eingesetzt, um diese organoide Kulturen entwickeln sind gewebespezifisch und Multi-Linie Differenzierung und imitieren so nah wie möglich der ursprünglichen Stammzellnische in-vivo. Organellen können potenzielle Anwendungen, einschließlich der Behandlung von Erbkrankheiten, die Beurteilung der therapeutische Wirksamkeit bei Krebs, die Analyse der Medikamententoxizität oder das Studium der Organogenese in-vitro-5haben.
Insgesamt ist die wichtigste Einschränkung der organoide Kulturen als aus Gewebeproben einen Mangel der Zelle-Spezifität. Zum Beispiel Darm Organellen hergestellt aus ganzen Darm Krypten erlauben nicht die Analyse der einzelnen Zellbestandteile umfasste innerhalb der Gewebe-Quelle (z.B.ganze Krypten enthalten Lgr5+, Paneth, und Vorläuferzellen).
Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, genannt ORA, die die Vorzüge der intestinalen organoide Kulturen mit der Funktionsanalyse der grundlegendsten Komponenten, nämlich Stamm (Lgr5+) und Nische (Paneth) Zellen verbindet. Dies geschieht durch die einzigartige Fähigkeit der Paneth und Lgr5+ -Zellen um körperlich zu verknüpfen mit einander wenn Co inkubiert und Anlass zu Organellen2,6,10 geben. Wir nutzten diese Funktion und vorbehandelt zwei Zelltypen einzeln vor, so dass sie Organellen zu rekonstruieren. Wenn Sie dies tun, kann jede Zelle-Komponente bestimmten Droge, Wachstumsfaktor, biochemische Inhibitor, Gentechnik oder chemische Behandlung vor der Rekonstitution und organoide Bildung ausgesetzt werden. Deshalb wird mit der ORA-Assay erlauben die Bestimmung, ob eine spezifische medikamentöse Behandlung oder gentechnische Veränderung hat eine spezifische Wirkung auf die Stammzellen oder ihre Nische Pendant.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die ORA ermöglicht die raffinierte funktionelle Analyse von zwei wesentlichen Komponenten der intestinalen Stammzellnische, nämlich Lgr5+ und Paneth Zellen. Dieser Ansatz wurde bisher von uns und anderen mit leichten Modifikationen6,10,11eingesetzt. Hier präsentieren wir Ihnen das ORA-Verfahren als eine reproduzierbare und standardisierte Laborprotokoll. Außerdem berichten wir über die Auswirkungen der <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde ermöglicht durch die Finanzierung von der niederländischen Krebsgesellschaft (KWF; EMCR 2012-5473) und World Cancer Research Fonds International (WCRF, Projekt Nr. 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
Riferimenti
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