Organoid rekonstituering analysen (ORA) for funksjonell analyse av Intestinal stammen og nisje celler
Summary
Intestinal organoid kulturer er etablert fra hele Krypter og tillater ikke analyse av selvtillit fornyelse og differensiering i en celle-spesifikk måte. Denne protokollen beskriver rekonstituering av sorterte stamme (Lgr5+) og nisje (Paneth) celler, som gir opphav til organoids mens deres tidligere biokjemiske og genetiske modifikasjoner og funksjonell analyse.
Abstract
Intestinal epitel er preget av en ekstremt rask omløpshastighet. I pattedyr, er hele epithelial fôr fornyet i 4-5 dager. Voksen intestinal stamceller finnes nederst i krypten i Lieberkühn, er øremerket av uttrykk av Lgr5 genet og bevare homeostase gjennom sine karakteristiske proliferativ høyt1. Gjennom hele tynntarmen, Lgr5+ stamceller er blandet med spesialiserte sekretoriske celler kalt Paneth celler. Paneth celler skiller antibakterielle forbindelser (dvs., lysozyme og cryptdins/defensins) og utøve en kontrollerende rolle på tarmfloraen. Flere nylig, en ny funksjon har blitt oppdaget for Paneth cellene, nemlig evnen til å gi nisje støtte til Lgr5+ stamceller gjennom flere viktige ligander som Wnt3 og EGF Dll12.
Når isolerte ex vivo og kultivert i nærvær av bestemte vekstfaktorer og ekstracellulær matrix komponenter, hele intestinal Krypter gi opphav til varige og selvtillit fornyelse 3D strukturer kalt organoids som ligner svært krypt-villus epitel arkitektur av voksen tynntarmen3. Organoid kulturer, når etablert fra hele crypts tillate studiet av selvtillit fornyelse og differensiering av intestinal stamcelleforskningen nisje, men uten å ta opp forholdet mellom de enkelte komponentene, nemlig den Lgr5+ og Paneth celler.
Her beskriver vi en ny tilnærming til den organoid analysen som utnytter muligheten for Paneth og Lgr5+ celler for å knytte og danner organoids da co kulturperler. Denne her referert til som “organoid rekonstituering analysen” (ORA), tillater den genetiske og biokjemiske modifikasjon av Paneth eller Lgr5+ stamceller, etterfulgt av rekonstituering i organoids. Slik kan funksjonell analyse av de to viktigste komponentene av intestinal stamcelleforskningen nisje.
Introduction
Intestinal epitel mest raskt selv fornyende vevet i pattedyr kroppen og, som sådan, har vært gjenstand for en overflod av studier for identifikasjon og funksjonell karakteristikk av voksne stamceller bosatt nederst på crypt av Lieberkühn, øremerket av uttrykk av Lgr5 genet og avhengig av kanoniske Wnt signaler1. Spesielt er Lgr5+ stamceller flankert og støttes av spesialiserte nisje celler, i.e. Paneth celler, som også avhenger av Wnt Signaliser for deres modning2. Sammen disse to celletyper populasjonsgjennomsnittet selvtillit fornyelse av intestinal epithelial fôr og bevare den daglige homøostatisk balanse: Lgr5+ stamceller raskt dele og gi opphav til stamfar og mer spesialiserte intestinal epithelial celler. Paneth celler gir viktig nisje faktorer (f.eksDll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ stamceller2. Kapasiteten til intestinal Krypter når belagt ex vivo å danne organisert og selv fornyende strukturer kalt organoids, eller “mini-guts”, har blitt utnyttet som en eksperimentell verktøy for å gi innsikt i prosesser som selvtillit fornyelse og differensiering i normal og patologiske forhold inkludert kreft4. Organoid kulturer er opprettet fra flere vev, inkludert tarmen, bukspyttkjertelen, leveren og nyre, fra både mus og prøver fra mennesker4. Utvinning metoden og vekstfaktorer ansatt for å utvikle disse organoid kulturer er vev-spesifikke og utformet for å kjøre flere avstamning differensiering og etterligne så nært den opprinnelige stamcelleforskningen nisje i vivo. Organoids kan ha potensielle programmer inkludert behandling av genetiske sykdommer, vurdering av terapeutiske effekten i kreft, analyse av medikament toksisitet eller studiet av organogenesen i vitro5.
Total, den viktigste begrensningen av organoid kulturer når etablert fra vevsprøver er mangel på celle-spesifisitet. For eksempel intestinal organoids etablert fra hele intestinal Krypter tillater ikke analyse av mobilnettet enkeltkomponenter omfattet vev kilden (f.ekshele Krypter inneholder Lgr5+, Paneth, og stamfar celler).
Her beskriver vi en roman metoden, kalles ORA, som kombinerer fordelene med intestinal organoid kulturer med funksjonell analyse av de mest grunnleggende komponentene, nemlig stem (Lgr5+) og nisje (Paneth) celler. Dette oppnås gjennom unike evne til Paneth og Lgr5+ cellene skal fysisk knytte hverandre når co ruges og gi opphav til organoids2,6,10. Vi tok nytte av denne funksjonen og pre-behandlet de to celletyper individuelt tidligere tillater seg å gjeninnføre organoids. Når du gjør dette, kan hver celle komponent utsettes for enhver gitt narkotika, vekstfaktor, biokjemiske inhibitor, genetisk modifisering eller kjemisk behandling før rekonstituering og organoid formasjon. Derfor kan bruker ORA analysen bestemme om en bestemt behandling eller genetisk modifisering har en bestemt effekt på stamceller eller deres nisje motpart.
Protocol
Representative Results
Discussion
ORA tillater raffinert funksjonell analyse av de to viktigste komponentene for intestinal stamcelleforskningen nisje, nemlig Lgr5+ og Paneth celler. Denne tilnærmingen har vært tidligere ansatt og andre små modifikasjoner6,10,11. Her presenterer vi ORA prosedyren som en reproduserbar og standardisert laboratorium protokoll. Også vi rapportere om virkningene av Apc downregulation i Lgr5<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble gjort mulig med midler fra den hollandske Kreftforeningen (KWF; EMCR 2012-5473) og World Cancer Research midler International (WCRF, prosjektet nr 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
Riferimenti
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
