El ensayo de reconstitución de organoides (ORA) para el análisis funcional del tallo Intestinal y las células del nicho
Summary
Organoide intestinal culturas establecen de criptas todas y no permite el análisis de auto renovación y diferenciación de una manera específica de la célula. Este protocolo describe reconstitución de potencia ordenada (Lgr5+) y lugar (Paneth) células, que dan lugar a organoides permitiendo su modificación bioquímica y genética previa y análisis funcional.
Abstract
El epitelio intestinal se caracteriza por un índice de rotación extremadamente rápida. En mamíferos, la guarnición epitelial toda se renueva dentro de los 4-5 días. Las células madre intestinales residen en la parte inferior de las criptas de Lieberkühn son asignadas por la expresión del gen Lgr5 y preservar la homeostasis a través de su característica alta tasa proliferativa1. A lo largo del intestino delgado, Lgr5+ las células madre están entremezcladas con células secretoras especializadas llamadas células de Paneth. Células de paneth secretan compuestos antibacterianos (por ejemplo, la lisozima y cryptdins/defensinas) y ejercen un papel que controlaba en la flora intestinal. Más recientemente, se ha descubierto una nueva función para las células de Paneth, es decir, su capacidad para proporcionar apoyo de nicho a células Lgr5+ a través de varios ligandos claves como Wnt3, EGF y Dll12.
Cuando aislado ex vivo y cultivadas en presencia de factores específicos de crecimiento y componentes de la matriz extracelular, criptas intestinales toda dan lugar a larga vida y uno mismo-renovar estructuras 3D llamado organitas muy parecidos a la cripta vellosidad arquitectura epitelial del intestino adulto3. Organoide culturas, cuando estableció de criptas enteras, permiten el estudio de auto renovación y diferenciación del nicho de células madre intestinales, aunque sin abordar la contribución de sus componentes individuales, es decir, la Lgr5+ y Células de Paneth.
Aquí, describimos un nuevo enfoque para el análisis de organoides que se aprovecha de la capacidad de Paneth y células Lgr5+ para asociarse y formar organoides cuando cultivadas conjuntamente. Este enfoque, aquí denominado “ensayo de reconstitución de organoide” (ORA), permite la modificación genética y bioquímica de Paneth o Lgr5+ células, seguidas de reconstitución en organoides. Como tal, permite el análisis funcional de los dos componentes principales del nicho de células madre intestinales.
Introduction
El epitelio intestinal es el tejido más rápidamente renueva a sí misma en el cuerpo mamífero y, como tal, ha sido objeto de una gran cantidad de estudios dirigidos a la identificación y caracterización funcional de las células madre adultas que residen en la parte inferior de la cripta de Lieberkühn, destinado por la expresión del gen Lgr5 y dependiente de señales Wnt canónico1. En particular, las células de vástago Lgr5+ flanqueadas y apoyadas por las células del nicho especializado, es decir, las células de Paneth, que también dependen de Wnt de señalización para su maduración2. Juntos, estos dos tipos celulares subyacen autorenovación de la guarnición epitelial intestinal y mantener el equilibrio homeostático diario: Lgr5+ células rápidamente se dividen y dan lugar a progenitoras y más especializan intestinal epitelial células; Células de Paneth proporcionan factores del nicho fundamental (p. ej., Dll1, Wnt3, EGF) para Lgr5+ células madre2. La capacidad de las criptas intestinales cuando plateado ex vivo para formar estructuras organizadas y renueva a sí misma llama organoides o “mini-entrañas”, se ha explotado como una herramienta experimental para proporcionar la penetración en procesos tales como la auto renovación y diferenciación en condiciones normales y patológicas incluyendo cáncer4. Se han establecido culturas organoide de varios tejidos, incluyendo el intestino, páncreas, hígado y riñón de ratón y muestras humanas4. El método de extracción y los factores de crecimiento empleados para el desarrollo de las culturas de estos organoides son específicas de tejido y diseñado para impulsar la diferenciación multilineal y mímico lo más cerca posible el original nicho de células madre en vivo. Organoides pueden tener aplicaciones potenciales incluyendo el tratamiento de enfermedades genéticas, la evaluación de eficacia terapéutica en el cáncer, el análisis de toxicidad de la droga o el estudio de la organogénesis in vitro5.
En general, la principal limitación de organoide culturas cuando establecido a partir de muestras de tejido es la falta de especificidad celular. Por ejemplo, organitas intestinales establecidas de criptas intestinales toda no permiten el análisis de los componentes celulares, englobado dentro de la fuente de tejido (por ejemplo, contienen criptas todo Lgr5+, Paneth, y células progenitoras).
Aquí, describimos un nuevo método, conocido como ORA, que combina las ventajas de las culturas organoide intestinal con el análisis funcional de sus componentes más fundamentales, a saber, madre (Lgr5+) y células de nicho (Paneth). Esto se logra a través de la capacidad única de Paneth y células de Lgr5+ para asociar físicamente a otro cuando co incuban y dan lugar a organoides2,6,10. Aprovechando esta característica y tratados previamente los dos tipos celulares individualmente antes de lo que les permite reconstituir el organitas. Al hacerlo, cada componente de la célula puede estar expuesto a determinada droga, factor de crecimiento, inhibidor bioquímico, modificación genética o tratamiento químico antes de la reconstitución y la formación de organoide. Por lo tanto, usando el análisis ORA permitirá la determinación de si un determinado tratamiento farmacológico o modificación genética tiene un efecto específico sobre las células madre o sus contrapartes de nicho.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ORA permite el refinado análisis funcional de los dos componentes esenciales del nicho de células madre intestinales, es decir, Lgr5+ y células de Paneth. Este enfoque ha sido empleado previamente por nosotros y otros con ligeras modificaciones6,10,11. Aquí, presentamos el procedimiento ORA como un protocolo de laboratorio estandarizadas y reproducibles. También, nos informe sobre los efectos de la de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue posible gracias a fondos de la sociedad holandesa del cáncer (KWF; EMCR 2012-5473) y el mundo el cáncer investigación fondos Internacional (WCRF, proyecto no. 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
Riferimenti
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
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