Organoid beredning analysen (ORA) för den funktionella analysen av Intestinal Stem och nisch celler
Summary
Intestinal organoid kulturer är etablerade från hela kryptor och tillåter inte analys av självförnyelse och differentiering i en cell-specifika mode. Det här protokollet beskriver beredning av sorterade stem (Lgr5+) och nischade (Paneth) celler, som ger upphov till organoids samtidigt som deras tidigare biokemisk och genetisk modifiering och funktionell analys.
Abstract
Intestinala epitelet kännetecknas av en extremt snabb omsättningshastighet. Hos däggdjur förnyas hela epitelial slemhinnan inom 4-5 dagar. Intestinal stamceller bor längst ned i kryptor av Lieberkühn, är öronmärkta av uttryck av genen Lgr5 och bevara homeostas genom sin karaktäristiska höga proliferativ kurs1. Hela tunntarmen, Lgr5+ stamceller samsas med specialiserade sekretoriska celler kallas Paneth celler. Paneth celler utsöndrar antibakteriell föreningar (dvs, lysozym och cryptdins/defensins) och utöva en kontrollerande roll på tarmfloran. Mer nyligen, har upptäckt en ny funktion för Paneth celler, nämligen deras kapacitet att stödja nisch Lgr5+ stamceller genom flera viktiga ligander som Wnt3, EGF och Dll12.
När isolerade ex vivo och odlade i närvaro av specifika tillväxtfaktorer och extracellulär matrix komponenter, hela tarmens kryptor ge upphov till långlivade och själv förnya 3D-strukturer som kallas organoids som mycket liknar de crypt-villus epitelial arkitekturen av vuxen tunntarmen3. Organoid kulturer, när etablerade från hela kryptor, tillåta studien av självförnyelse och differentiering av intestinal stamcellsnischen, men utan att ta itu med bidrag av dess enskilda komponenter, nämligen den Lgr5+ och Paneth celler.
Här beskriver vi en ny metod för organoid analysen som tar fördel av möjligheten för Paneth och Lgr5+ celler för att associera och bildar organoids när Co odlade. Detta synsätt, här benämnd ”organoid beredning assay” (ORA), tillåter de genetiska och biokemiska modifieringen av Paneth eller Lgr5+ stamceller, följt av beredning i organoids. Som sådan, gör det den funktionella analysen av de två viktigaste delarna av intestinal stamcellsnischen.
Introduction
Intestinala epitelet är den mest snabbt själv förnya vävnaden i kroppen hos däggdjur och, som sådan, har varit föremål för en uppsjö av studier syftar till att identifiera och funktionell karakterisering av de adulta stamceller som bor längst ned i kryptan av Lieberkühn, öronmärkta av uttryck av genen Lgr5 och beroende av kanoniska Wnt signaler1. Noterbart är Lgr5+ stamceller flankerad och stöds av specialiserade nisch celler, dvs Paneth celler, vilket också beror på Wnt signalering för deras mognad2. Tillsammans, dessa två celltyper ligger bakom självförnyelse av intestinal epitel slemhinnan och bevara den dagliga homeostatiska balansen: Lgr5+ stamceller snabbt dela upp och ge upphov till stamceller och mer specialiserade intestinal epitelial celler; Paneth celler ger väsentliga nisch faktorer (t.ex., Dll1, Wnt3, EGF) till Lgr5+ stamceller2. Kapaciteten för intestinal kryptor när guldpläterade ex vivo att bilda organiserade och själv förnya strukturer kallas organoids, eller ”mini-tarmar”, har utnyttjats som en experimentell verktyg för att ge insikt i processer såsom självförnyelse och differentiering i normala och patologiska förhållanden inklusive cancer4. Organoid kulturer har fastställts från flera vävnader, inklusive tarmen, bukspottkörtel, lever och njure, från både mus och mänskliga prover4. Metoden utvinning och de tillväxtfaktorer som anställd att utveckla dessa organoid kulturer är vävnadsspecifika och utformade att köra flera härstamning differentiering och så nära som möjligt efterliknar ursprungliga stamcellsnischen invivo. Organoids kan ha potentiella tillämpningar inklusive behandling av genetiska sjukdomar, bedömning av terapeutisk effekt i cancer, analys av drug toxicitet eller studiet av organogenes in vitro-5.
Sammantaget är den största begränsningen av organoid kulturer när etablerade från vävnadsprover brist på cell-specificitet. Till exempel intestinal organoids etablerat från hela tarmens kryptor inte tillåter analys av enskilda cellkomponenter omfattade inom vävnad källan (t.ex., hela kryptor innehåller Lgr5+, Paneth, och progenitorceller).
Här beskriver vi en ny metod, kallad ORA, som kombinerar fördelarna med intestinal organoid kulturer med den funktionella analysen av dess mest grundläggande komponenter, nämligen stammen (Lgr5+) och nisch (Paneth) celler. Detta uppnås genom den unika förmågan av Paneth och Lgr5+ celler för att fysiskt associera med varandra när Co inkuberas och ge upphov till organoids2,6,10. Vi drog fördel av denna funktion och pre behandlas de två celltyper individuellt innan de tillåts att rekonstruera organoids. När du gör så, varje cell komponent kan utsättas för någon viss drog, tillväxtfaktor, biokemiska hämmare, genmodifiering eller kemisk behandling innan beredning och organoid bildandet. Alltså kommer att med ORA analys möjliggöra fastställandet av huruvida en specifik läkemedelsbehandling eller genetisk modifiering har en specifik effekt på stamcellerna eller deras nisch motsvarighet.
Protocol
Representative Results
Discussion
ORA tillåter den raffinerade funktionell analysen av de två väsentliga delarna av intestinal stamcellsnischen, nämligen Lgr5+ och Paneth celler. Detta tillvägagångssätt har tidigare varit anställd av oss och andra med smärre ändringar6,10,11. Här presenterar vi ORA förfarandet som ett reproducerbart och standardiserade laboratorium protokoll. Också, vi rapportera om effekterna av Apc ned…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie har möjliggjorts genom finansiering från den holländska Cancer Society (KWF; EMCR 2012-5473) och World Cancer Research medel International (WCRF; projekt nr 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
Riferimenti
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
