Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)
Summary
Bağırsak organoid kültürler tüm kriptalarının kurulur ve kendini yenileme ve farklılaşma analizi bir hücre özgü biçimde izin vermez. Bu iletişim kuralı sulandırma sıralanmış kök (Lgr5+) açıklar ve neden olmaktadır organoids için onların önceki biyokimyasal ve genetik modifikasyon ve fonksiyonel analiz etkinleştirilirken (Paneth) hücreleri niş.
Abstract
Bağırsak epiteli tarafından son derece hızlı devir hızı ile karakterizedir. Memelilerde, 4-5 gün içinde tüm epitel astar yenilenir. Yetişkin bağırsak kök hücre Lieberkühn kriptalarının alt kısmında bulunan, Lgr5 gen ifade tarafından ayrılmış bulunmaktadır ve ile onların karakteristik yüksek proliferatif oranı1homeostazı korumak. İnce bağırsak boyunca Lgr5+ kök hücre Paneth hücreleri denilen özel salgı hücreleri ile iç içe. Paneth hücreleri antibakteriyel bileşikler (Yani, lizozim ve cryptdins/defensins) salgılar ve bağırsak florasının denetleme rolünü uygulamayın. Son zamanlarda, yeni bir işlev Paneth hücreleri, yani kendi kapasitesi Wnt3, EGF ve Dll12olarak birkaç anahtar ligandlar ile Lgr5+ kök hücreleri için niş destek sağlamak için keşfetti.
Ne zaman ex vivo izole ve belirli büyüme faktörleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin huzurunda kültürlü, tüm bağırsak kriptalarının için uzun ömürlü ortaya çıkmasına ve 3D yapılar kendini sürekli yenileyen denilen son derece crypt villus benzer organoids 3yetişkin ince bağırsak epitel mimarisi. Organoid kültürler, tüm kriptalarının kurulan zaman bireysel bileşenleri, yani Lgr5+ katkısı olsa adresleme olmadan kendini yenileme, çalışma ve bağırsak kök hücre niş farklılaşma izin ve Paneth hücreleri.
Burada, biz Paneth yeteneği yararlanır organoid tahlil için yeni bir yaklaşım tarif ve Lgr5+ hücreleri ilişkilendirmek ve organoids oluşturmak için zaman ortak kültürlü. Burada “organoid sulandırma tahlil” olarak adlandırılan bu yaklaşım (ORA), Paneth genetik ve biyokimyasal modifikasyonu sağlar veya Lgr5+ organoids sulandırma tarafından takip, kök hücre. Bu nedenle, iki ana bileşen bağırsak kök hücre niş fonksiyonel analiz sağlar.
Introduction
Bağırsak epitel memeli vücuttaki en hızlı kendini yenileyerek doku ve, bu nedenle, nesne kimliği ve Türbenin alt kısmında bulunan yetişkin kök hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu yönelik çalışmalar bir bolluk olmuştur Lieberkühn, ifade Lgr5 gen tarafından ayrılmış ve kurallı Wnt sinyal1bağımlı. Özellikle Lgr5+ kök hücre çevrili ve özel niş hücreleri, Yani da kendi olgunlaşma2için Wnt sinyal üzerinde bağlıdır Paneth hücreleri tarafından desteklenen. Birlikte, bu iki hücre tipleri öz-yenileme bağırsak epitel astar altında yatan ve günlük homeostatik denge korumak: Lgr5+ kök hücre hızla Böl ve yaratıcı için ortaya çıkmasına ve daha fazla bağırsak İhtisas epitel hücreleri; Paneth hücreleri sağlamak temel niş faktörler (örneğin, Dll1, Wnt3, EGF) için Lgr5+ kök hücreleri2. Kapasite organize ve kendini yenileyerek yapıları oluşturmak için kaplama ex vivo organoids veya “mini-cesaret”, çağrıldığında bağırsak kriptalarının kendini yenileme gibi süreçleri içgörü sağlamak için deneysel bir araç olarak kullanan ve farklılaşma kanser4de dahil olmak üzere normal ve patolojik koşullarda. Organoid kültürlerden gelen çeşitli dokular, bağırsak, pankreas, karaciğer ve böbrek, fare ve insan örnekleri4de dahil olmak üzere kurulmuştur. Çıkarma yöntemi ve bu organoid kültürler geliştirmek için istihdam büyüme faktörleri doku özgü ve çoklu soy farklılaşma sürücü ve mümkün olduğunca özgün kök hücre niş taklit etmek için tasarlanmış içinde vivo. Organoids genetik hastalıklar tedavi, kanser tedavi edici etkinliği, ilaç toksisitesi analizi veya organogenesis vitro5çalışmanın değerlendirilmesi de dahil olmak üzere potansiyel uygulamalar olabilir.
Genel olarak, doku örnekleri kuruldu organoid kültürlerin ana sınırlama hücre-özgüllük olmaması. Örneğin, tüm bağırsak kriptalarının kurulan bağırsak organoids içinde doku kaynağı kapsıyordu hücresel bileşenleri tek tek analiz izin verme (örneğin, tüm kriptalarının içeren Lgr5+, Paneth, ve progenitör hücre).
Burada, ORA anılacaktır ve bağırsak organoid kültürler avantajlarını en temel bileşenleri, yani kök (Lgr5+) ve niş (Paneth) hücrelerin fonksiyonel analiz ile birleştiren yeni bir yöntem, açıklayın. Bu Paneth benzersiz yeteneği elde edilir ve fiziksel olarak ortak inkübe ve organoids2,6,10‘ a ortaya çıkmasına birbirleri ile ilişkilendirmek için Lgr5+ hücreleri. Biz bu özelliğin avantajlarından aldı ve iki hücre türleri tek tek izin vermeden önce onları organoids reconstitute önceden tedavi. Bunu yaparken, her hücre bileşeni herhangi bir verilen ilaç, büyüme faktörü, biyokimyasal inhibitörü, genetik modifikasyon veya önce sulandırma ve organoid oluşumu kimyasal işleme maruz kalabilirler. Bu nedenle, ORA tahlil kullanarak bir özel uyuşturucu tedavi veya genetik değişiklik kök hücre veya onların niş karşılığı belirli bir etkiye sahip olup olmadığını belirler belirlenmesi sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
ORA iki temel bileşenleri bağırsak kök hücre niş, yani Lgr5+ ve Paneth hücreleri rafine fonksiyonel analiz sağlar. Bu yaklaşım daha önce bize ve diğerleri tarafından hafif değişiklikler6,10,11ile istihdam edilmiştir. Burada, ORA yordamı bir tekrarlanabilir ve standart laboratuvar iletişim kuralı olarak mevcut. Ayrıca, biz Lgr5+ kök hücre, Apc downregülasyon …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Hollanda Kanser Derneği (KWF; fon tarafından mümkün yapıldı EMCR 2012-5473) ve dünya kanser araştırma fonları International (WCRF; Proje No 2014-1181)
Materials
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
Riferimenti
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965 (2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
