Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay
Summary
Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.
Abstract
Pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) ist ein ex-Vivo Lunge Explant und geschlossenen Zellkultursystem, die es Forschern erlaubt, die Biologie der Lunge Besiedlung in Osteosarkom (OS) durch Fluoreszenz-Mikroskopie zu studieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung des Protokolls und erläutert, Beispiele von Bilddaten auf metastasiertem Wachstum mit Weitfeld oder konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen zu erhalten. Die Flexibilität des Modells PuMA erlaubt Forschern, nicht nur das Wachstum von OS-Zellen in der Lunge Mikroumgebung zu studieren, sondern auch die Auswirkungen der anti-metastatischen Therapeutika im Zeitverlauf zu beurteilen. Konfokale Mikroskopie ermöglicht eine noch nie da gewesenen, hochauflösende Bildgebung von OS-Zell-Interaktionen mit dem Lungenparenchym. Darüber hinaus Wenn das PuMA-Modell mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszierende Protein genetische Reporter kombiniert wird, können Forscher die Lunge Mikroumgebung, zellulärer und subzellulärer Strukturen und Genfunktion Promotoraktivität in metastasierenden OS Zellen untersuchen. Das PuMA-Modell bietet ein neues Tool für Osteosarkom-Forscher entdecken neue Metastasen Biologie und die Aktivität der neuartigen anti-metastatischen, gezielte Therapien zu bewerten.
Introduction
Bessere Ergebnisse für pädiatrische Patienten mit metastasierendem Osteosarkom (OS) bleibt noch ein kritischer ungedeckten klinischen Bedarf 1. Dies unterstreicht die Bedeutung der Entwicklung neuer molekular zielgerichtete Therapien. Herkömmliche Chemotherapeutika, die Ziel-Tumor-Zell-Proliferation haben nicht als wirksam erwiesen bei der Behandlung von Metastasen und damit neue Strategien muss der metastatischen Prozess selbst 2ausgerichtet. Der aktuelle Artikel beschreibt die praktischen Aspekte der eine relativ neue Art von ex Vivo Lunge Metastasen Modell, entwickelt von Mendoza und Kollegen3, wonach ein nützliches Werkzeug bei der Entdeckung neuer pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) molekularen Treiber in der Lunge Metastasen Progression in OS 4,5. Bevor Sie fortfahren, es wäre klug, kurz auf einige aktuelle Modelle von Metastasen zu berühren, und wie das PuMA-Modell bietet mehrere Vorteile gegenüber konventionellen in-vitro- Tests.
Die meisten experimentelle Modellen genutzt, um Metastasen zu untersuchen umfassen in Vitro und in Vivo -Systeme, die entweder einem bestimmten Schritt oder mehrere Stufen der metastatischen Kaskade zu rekapitulieren. Diese Schritte umfassen: (1) die Migration vom Primärtumor, 2) Intravasation in nahe gelegenen Gefäße (Blut- oder Lymphgefäße) und Transitländern im Umlauf, Tumorzellen (3) verhaften am sekundären Standort, 4) Extravasation und Überleben am sekundären Standort, Bildung (5) Fixierungsprotokoll, und 6) Wachstum in vaskularisierte Metastasen (Abbildung 1). In-vitro- Modelle von Metastasen können 2-dimensionale (2D) Migration und 3-dimensionale (3D) Matrigel Invasion Assays, die in überprüft werden ausführlich an anderer Stelle 6. Für in-Vivo -Modelle, die zwei häufig verwendete Modellsysteme umfassen: 1) das spontane Metastasierung Modell ist wo ein Tumor-Zellen sind Orthotopically, die in einem bestimmten Gewebetyp einen lokalen Tumor bilden, die spontan metastasierende Zellen wirft injiziert an entfernten Standorten; (2) die experimentelle Metastasierung Modell ist wo Tumorzellen in das Blutgefäß stromaufwärts von dem Zielorgan injiziert werden. Zum Beispiel eine Rute Vene Injektion von Tumor-Zellen-Ergebnisse in der Entwicklung Lunge Metastasen5,7,8. Andere experimentelle Metastasen-Modelle verfügen über Injektion von Tumorzellen in die Milz oder mesenterialen Vene führt zu die Entwicklung von Lebermetastasen9,10. Praktische Erwägungen dieser in-Vivo -Modelle werden von Welch 11ausführlich erörtert. Ein weiteres in-Vivo -Modell zur Untersuchung von Metastasen in den pädiatrischen Sarkome ist der Nieren Nieren subkapsuläre Tumor Implantation Modell ergibt sich lokale Tumorbildung und spontane Metastasen in der Lunge 12,13. Eine technisch anspruchsvolle Technik wie intravitalen Videomicroscopy können direkt sichtbar zu machen, in Echtzeit, Wechselwirkungen zwischen metastatischen Krebszellen und den Microvasculature einer metastatischen Website (dh. Lunge oder Leber) wie beschrieben von MacDonald14 und Entenberg15oder Krebs Zelle Extravasation in der chorioallantoic Membrane wie beschrieben durch Kim 16.
Das PuMA-Modell ist ein ex-Vivo, Lunge Gewebe Explant, geschlossenes Kultursystem wo kann das Wachstum von Tumorzellen fluoreszierende längs über Fluoreszenz-Mikroskopie über einen Zeitraum von einem Monat beobachtet werden (siehe Abb. 2A). Dieses Modell rekapituliert die Anfangsphase der Lunge Kolonisation (Schritte 3-5) in der metastasierten Kaskade. Einige große Vorteile gegenüber konventionellen in-vitro- Modellen des Modells PuMA sind: 1) Es bietet die Möglichkeit, metastasiertem Krebs Zelle Wachstum in einem 3D Mikroumgebung längs zu messen, die viele Funktionen der Lunge Mikroumgebung behält Vivo 3; (2) PuMA ermöglicht den Forscher zu beurteilen, ob der Zuschlag einer Kandidaten-gen oder Drogenmissbrauch Behandlung Anti-metastatischen Aktivitäten im Zusammenhang mit einem 3D Lunge Mikroumgebung hat; (3) das PuMA-Modell sind flexibel mit vielen Arten von Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattformen (Abbildung 2 b) wie Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie oder konfokale Laser-scanning-Mikroskopie, Beispiele für jede Abbildung 2 & Dzeigt, bzw.. Dieser Artikel wird erläutert, wie mithilfe der PuMA-Modell um längs Bilddaten auf metastasiertem Wachstum der erweiterten grün fluoreszierendes Protein (eGFP) zu erhalten-mit dem Ausdruck, menschliche Ebbe und metastasierendem Osteosarkom Zellen (MNNG und HOS Zellen) mit niedrig-Vergrößerung Weitfeld Fluoreszenz. Beispiele für imaging ein Fluoreszenzfarbstoff, der Lungenparenchyms Etiketten und ein rot-fluoreszierende Protein, die genetische Reporter der Mitochondrien in OS Etiketten im PuMA Modell konfokale Laser-scanning-Mikroskopie mit Zellen werden ebenfalls besprochen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die folgende technischen Artikel beschreibt einige praktische Aspekte des Modells bei der Untersuchung der Lunge Kolonisation in OS PuMA. Im folgenden: einige wichtige Schritte in das Protokoll, wo Forscher besonders vorsichtig nehmen sollte
(a) Kanülierung der Luftröhre. Die Luftröhre kann leicht beschädigt werden, während sie sezieren die umliegenden Muskeln und Bindegewebe. Darüber hinaus kann die Nadel des Katheters leicht durch die Luftröhre gedrückt werden. Achten Sie besonders a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken Dr. Arnulfo Mendoza in der PuMA-Technik geschult. Darüber hinaus möchten wir DRS. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) und Sam Aparicio (BC Cancer Agency) für die Nutzung von ihren Mikroskopen im Laufe dieser Studie anerkennen. Diese Forschung wurde von Intramural Research Program des National Institutes of Health, Center for Cancer Research, Pädiatrische Onkologie-Zweig (teilweise) unterstützt. M.M.L. vom nationalen Instituten der Gesundheit intramuralen Besuch Fellow Programm (Award 15335) unterstützt wurde und wird derzeit von einem Joan-Parker-Stipendium in Metastasen Forschung unterstützt. P.H.S. wird von der British Columbia Cancer Foundation unterstützt.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
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