कैंसर कोशिका लाइनों में जीन अभिव्यक्ति की सशर्त पछाड़ना के लिए Monocytes/मैक्रोफेज की भर्ती का अध्ययन करने के लिए ट्यूमर Microenvironment
Summary
इस प्रोटोकॉल कैंसर सेल लाइनों और उसके बाद के उपयोग में एक कार्यात्मक Tet-ON प्रणाली की स्थापना के लिए एक योजना के रूप में कार्य करता है, ट्यूमर कोशिका की भूमिका के अध्ययन के लिए विशेष रूप से monocytes/मैक्रोफेज की भर्ती में प्रोटीन व्युत्पंन ट्यूमर microenvironment के लिए ।
Abstract
सिरना और shRNA-मध्यस्थता नीचे दस्तक (केडी) जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के तरीके जीन और प्रोटीन समारोह को समझने के लिए अमूल्य उपकरण हैं । हालांकि, इस मामले में है कि ब्याज की प्रोटीन के केडी कोशिकाओं या केडी के प्रत्याशित प्रभाव पर एक घातक प्रभाव है समय पर निर्भर है, बिना शर्त केडी तरीकों उचित नहीं हैं । सशर्त प्रणालियों इन मामलों में अधिक उपयुक्त है और अधिक ब्याज का विषय रहा है । इनमें Ecdysone-inducible एक्सप्रेस सिस्टम, Cytochrome पी-४५० प्रेरण प्रणाली1, और टेट्रासाइक्लिन विनियमित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली शामिल हैं ।
टेट्रासाइक्लिन विनियमित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में shRNA अभिव्यक्ति की प्रेरण द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति पर प्रतिवर्ती नियंत्रण सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल में, हम जीन अभिव्यक्ति के सशर्त विनियमन के लिए मानव कैंसर सेल लाइनों में कार्यात्मक Tet-ऑन सिस्टम का उपयोग कर एक प्रयोगात्मक डिजाइन प्रस्तुत करते हैं । हम तो ट्यूमर सेल के अध्ययन में इस प्रणाली के उपयोग के प्रदर्शन-monocyte बातचीत ।
Introduction
ट्यूमर एसोसिएटेड मैक्रोफेज (TAMs) ट्यूमर विकास को बढ़ावा देने, मेटास्टेसिस, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने के द्वारा ट्यूमर के लिए योगदान2. कैंसर कोशिकाओं भड़काऊ monocytes, जो ट्यूमर घुसपैठ और समर्थक tumorigenic TAMs3में अंतर भर्ती । TAMs के साथ ट्यूमर की घुसपैठ गरीब नैदानिक परिणाम के साथ संबद्ध है और मैक्रोफेज4,5के गुर्दे भूमिका से जोड़ा गया है । हालांकि, ट्यूमर के लिए मैक्रोफेज की भर्ती के तंत्र अच्छी तरह से पता लगाया है और शामिल रास्ते की एक बेहतर समझ क्षेत्र और होनहार चिकित्सा के आगे उन्नति के लिए महत्वपूर्ण है नहीं कर रहे हैं । ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर microenvironment (टीएमई) में सामान्य कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने में चुनौतियों में से एक तंत्र और कोशिकाओं शामिल की जटिलता है, इन विट्रो दृष्टिकोण है कि crosstalk के विच्छेदन की अनुमति की आवश्यकता होती है । यहाँ हम एक बहुमुखी पद्धति है कि एक कैंसर कोशिका के paracrine प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता वर्तमान-व्युत्पंन, मैक्रोफेज की तरह अन्य कोशिका प्रकार के प्रवास पर स्रावित प्रोटीन, इन विट्रो में. एक ऐसी प्रणाली का उपयोग करना जहाँ कैंसर कोशिका-monocytes की भर्ती में शामिल प्रोटीन के खिलाफ shRNA की अभिव्यक्ति टेट्रासाइक्लिन inducible प्रवर्तक के नियंत्रण में है, paracrine पर स्रावित प्रोटीन का monocytes प्रभाव quantitated है. इस प्रोटोकॉल में, टेट्रासाइक्लिन विनियमित वेक्टर में shRNA दृश्यों की क्लोनिंग स्थिर कैंसर सेल लाइनों की पीढ़ी के बाद प्रस्तुत किया है । इसके अलावा, प्राथमिक मानव monocytes और एक Boyden चैंबर परख की शुद्धि के लिए एक कैंसर कोशिका monocytes के प्रवास पर प्रोटीन प्राप्त paracrine प्रभाव का विश्लेषण किया जाता है ।
प्रोटीन के Downregulation जीन कोडिंग सामांयतः सिरना और shRNA तकनीक के साथ लागू किया जाता है, हालांकि इसके उपयोग में सीमाओं के बिना नहीं । लंबी अवधि के दस्तक-नीचे (केडी) जीन की कोशिकाओं है कि प्रयोगात्मक परिणामों के साथ हस्तक्षेप के माध्यमिक अनुकूली प्रतिक्रियाओं में लाना हो सकता है । जीन अभिव्यक्ति पर अस्थाई नियंत्रण की कमी यह समय या सेल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण एक प्रोटीन की भूमिका के साथ एक प्रोटीन की गतिशील भूमिका का अध्ययन करने के लिए चुनौती देता है । इस मुद्दे में विशेष रूप से vivo सेटिंग्स में महत्वपूर्ण है, जहां ट्यूमर के विकास और प्रगति में एक प्रोटीन की भूमिका के लिए केवल ट्यूमर की स्थापना के बाद ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति की downregulation की आवश्यकता हो सकती है । सशर्त केडी कोशिकाओं पर केडी के एक बहुत जल्दी घातक प्रभाव को रोकने का लाभ है, और ट्यूमर के विकास के विभिंन चरणों के भीतर प्रोटीन की भूमिका का विश्लेषण सक्षम है, जबकि बिना शर्त केडी ट्यूमर के विकास की कमी में परिणाम सकता है ।
सशर्त केडी प्रणालियों की एक संख्या स्थिर केडी की सीमाओं का पता करने के लिए विकसित किया गया है । सशर्त जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों में शामिल है Ecdysone-inducible एक्सप्रेस सिस्टम, Cytochrome पी-४५० प्रेरण प्रणाली1, और टेट्रासाइक्लिन विनियमित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली । टेट्रासाइक्लिन-विनियमित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली एंटीबायोटिक टेट्रासाइक्लिन (या इसके अधिक स्थिर एनालॉग-doxycycline) के अलावा पर shRNA की अभिव्यक्ति पर नियंत्रण की अनुमति देते हैं । tet-ऑन सिस्टम्स में, shRNA की अभिव्यक्ति टेट्रासाइक्लिन/doxycycline की उपस्थिति में एक जीन अभिव्यक्ति केडी में जिसके परिणामस्वरूप प्रेरित है, जबकि tet-बंद प्रणालियों में, shRNA की अभिव्यक्ति जीन अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में दबा दिया जाता है. टेट्रासाइक्लिन-inducible प्रणाली की एक खामी पहले doxycycline के अभाव में shRNA की अभिव्यक्ति के निम्न स्तर की सूचना दी है-तथाकथित leakiness6,7. tet-ऑन सिस्टम में यहां वर्णित, टेट्रासाइक्लिन के प्रशासन पर, constitutively के बंधन टेट्रासाइक्लिन दमन (TetR) के लिए tet-उत्तरदायी तत्व (TRE) के लिए प्रोटीन ब्याज की एच 1 प्रमोटर क्षेत्र के भीतर shRNA व्यक्त की है दबा. shRNA की अभिव्यक्ति में यह परिणाम और एक टेट्रासाइक्लिन-निर्भर तरीके से ब्याज की प्रोटीन के अनुवाद के निषेध8,9।
अन्य उपलब्ध Tet-ऑन सिस्टम टाटा बॉक्स और समीपस्थ अनुक्रम तत्व (सार्वजनिक उपक्रम) के बीच और टाटा बॉक्स और प्रतिलेखन शुरू चान एट अलद्वारा विकसित की साइट के बीच TetO अनुक्रम के एक साथ दस्तक में शामिल हैं । 10 इस प्रणाली के लिए shRNA अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए टेट्रासाइक्लिन की तुलना में कम विषाक्त खुराक की आवश्यकता है, तथापि, एक गैर प्रेरित राज्य के तहत, shRNA के निंन स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं । Krüppel-एसोसिएटेड बॉक्स (KRAB) आधारित Tet-ऑन सिस्टम11 में KRAB, जिंक फिंगर प्रोटीन, जो KRAB बाइंडिंग साइट के एक 3 केबी रेंज के भीतर स्थित जीन transcriptional दमन करने के लिए शामिल हैं । chimeric प्रोटीन tTRKRAB TetO के लिए बाध्य कर सकते हैं, और डीएनए नियंत्रणीय क्षमता की बड़ी रेंज के कारण, TetO प्रतिलेखन शुरू साइट और प्रमोटर के बीच सीमित होने की जरूरत नहीं है और प्रमोटर की गतिविधि पर कम प्रभाव पड़ता है । गैर प्रेरित राज्य के तहत, इस नियंत्रणीय आरएनए हस्तक्षेप प्रणाली shRNA11,12की लीक अभिव्यक्ति का एक निचला स्तर दिखाने के लिए सूचित किया गया था; हालांकि, यह एक अनुक्रमिक, दो वेक्टर क्लोनिंग दृष्टिकोण की आवश्यकता है । पहले विकसित की तुलना में ऐसी Ecdysone-inducible एक्सप्रेस प्रणाली या Cytochrome पी-४५० प्रेरण प्रणाली के रूप में सशर्त केडी प्रणालियों, टेट्रासाइक्लिन विनियमित प्रणाली अपनी मजबूती और reversibility का लाभ है, और इसलिए सबसे नियमित रूप से इस्तेमाल किया प्रणाली13। प्रणाली इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया दोहरी TetO दस्तक पर लाभ प्रणाली में और KRAB Tet-प्रणाली पर है के रूप में यह सीधे आगे की आवश्यकता है, एकल वेक्टर क्लोनिंग, कई क्लोनों के त्वरित पीढ़ी की अनुमति है, और यह प्रदर्शन में leakiness के बहुत कम स्तर doxycycline की अनुपस्थिति ।
टीएमई कैंसर के विकास के लिए महत्वपूर्ण है । ट्यूमर के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए, कैंसर कोशिकाओं chemotactic प्रोटीन स्रावित द्वारा भड़काऊ monocytes भर्ती । भर्ती monocytes ट्यूमर और प्रो-tumorigenic TAMs है कि ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस में योगदान में अंतर घुसपैठ । इन विट्रो में प्रतिरक्षा सेल भर्ती का उपयोग प्रवास परख, Boyden चैंबर परख के साथ व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है14,15,16,17। इस परख में, chemoattractant प्रोटीन स्रोत, उदाहरण के लिए, कैंसर की कोशिकाओं, या एक शुद्ध प्रोटीन, नीचे चैंबर में रखा गया है । प्रतिरक्षा कोशिकाओं ऊपरी कक्ष में नीचे डिब्बे से छिद्रित झिल्ली के साथ अलग रखा जाता है । कोशिकाओं chemoattractant के बढ़ते ढाल की ओर पलायन, और झिल्ली के निचले हिस्से पर पाया उन दाग और माइक्रोस्कोप के तहत गिना रहे हैं । यहां हम स्थिर पैदा करके monocytes पर Plasminogen उत्प्रेरक अवरोधक 1 (पै-1) के chemoattractant समारोह का परीक्षण, inducible कैंसर सेल लाइनों जहां पै की अभिव्यक्ति-1 doxycycline इसके अलावा द्वारा विनियमित है । monocyte प्रवास में पै-१ की भूमिका का आकलन करने के लिए हम मानव प्राथमिक monocytes का Boyden चेम्बर प्रवास परख में उपयोग करते हैं. THP1 जैसे मानव प्राथमिक monocytes और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया monocytic सेल लाइनों के बीच अंतर रिपोर्ट किया गया है और विभिन्न cytokine अभिव्यक्ति पैटर्न18शामिल हैं; उदाहरण के लिए, मानव monocytes19की तुलना में THP1 कक्षों द्वारा TNF-α व्यंजक स्तरों में 5-10 गुना वृद्धि. THP1 कोशिकाओं मानव ल्यूकेमिया monocytic कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं, बनाए रखने के लिए आसान कर रहे हैं, और 19-50एच20 के एक औसत दोहरीकरण समय के साथ पैदा. इसके विपरीत, मानव monocytes वृद्धि कारकों के अभाव में एक छोटी उम्र की विशेषता है । चूंकि monocytes दाताओं के रक्त से शुद्ध कर रहे हैं, परिवर्तनशीलता का एक उचित मात्रा में व्यक्तियों के बीच होता है और शुद्धि विधि पर निर्भर करता है, अन्य कोशिका प्रकार के साथ संदूषण हो सकता है. फिर भी, प्राथमिक monocytes प्रासंगिक है और इसे का उपयोग करें या जैविक अनुसंधान में प्राथमिक monocytes का उपयोग कर monocytic सेल लाइनों के साथ प्राप्त परिणामों की पुष्टि की सिफारिश की गई है19। यहां हम परिधीय रक्त से मानव प्राथमिक monocytes के शोधन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । monocyte शुद्धिकरण के वैकल्पिक तरीकों घनत्व ढाल और आसंजन प्रोटोकॉल और Ficoll के एकल ढाल के साथ दो कदम प्रक्रिया-Hypaque एक Percoll ढाल द्वारा पीछा शामिल21। monocyte जनसंख्या की शुद्धता उन विधियों द्वारा प्राप्त की ७०-९०% के बीच पर्वतमाला । विधि यहां वर्णित एक घनत्व एक नकारात्मक प्रतिरक्षा चयन22 के बाद ढाल का उपयोग करता है और एंटीबॉडी के साथ सीधे संपर्क के बिना मानव monocytes की शुद्धि को सक्षम बनाता है, जिससे उनके आकस्मिक सक्रियण से बचने और एक में जिसके परिणामस्वरूप > ९५% monocytes की शुद्ध जनसंख्या ।
प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत एक कार्यात्मक Tet-मानव कैंसर सेल लाइनों में जीन अभिव्यक्ति केडी के लिए प्रणाली पर स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है कैंसर के chemoattractant प्रभाव-स्रावित प्रोटीन पै-1 monocytes पर व्युत्पंन । पै-1 ट्यूमर की एक किस्म से व्यक्त की है और अपनी अभिव्यक्ति विडंबना गरीब नैदानिक परिणाम23,24के साथ संबद्ध है । पै-1 की प्रो-tumorigenic भूमिका इसके प्रो-angiogenic और एंटी-अपोप्तोटिक फंक्शन्स25,26का परिणाम है । पै-1 सूजन के लिए मैक्रोफेज की भर्ती को बढ़ावा देने के द्वारा सूजन में योगदान करने के लिए दिखाया गया है27। पै-1 चिकनी मांसपेशी को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था cellmigration28,29 और में भाग लेने के लिए मैक-1 निर्भर macrophage माइग्रेशन30. पै-1 का इजहार भी काफी B16F10 मेलेनोमा ट्यूमर में रॉ २६४.७ मैक्रोफेज की भर्ती में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है31. हालांकि टैम माइग्रेशन में पै-1 की भूमिका की जांच विस्तार से नहीं की गई है । हम वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करने के सवाल का जवाब है कि क्या पै-1 कैंसर कोशिकाओं को monocytes आकर्षित करती है । यह पद्धति कैंसर कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन मुंह और टीएमई के घटकों का विश्लेषण करके ट्यूमर और टीएमई के बीच crosstalk के विच्छेदन की अनुमति देता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
कोशिका प्रकार की एक किस्म से बना है, टीएमई कैंसर के विकास के लिए महत्वपूर्ण है । इष्टतम विकास की स्थिति का पता लगाने के लिए, कैंसर कोशिकाओं chemotactic कारकों के स्राव के माध्यम से monocytes को आकर्षित । यहां हम इन व?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पांडुलिपि को ठीक करने के लिए Jacqueline रोसेनबर्ग को स्वीकार करना चाहते हैं । यह काम अमेरिका के स्वास्थ्य और मानव सेवा के विभाग द्वारा समर्थित किया गया था या DeClerck (ग्रांट 5R01 सीए १२९३७७) और टी जे Martell फाउंडेशन के लिए अनुदान के साथ स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों । MH कुबल बच्चों के अस्पताल लॉस एंजिल्स में सबन अनुसंधान संस्थान के एक अनुसंधान कैरियर विकास फैलोशिप पुरस्कार के प्राप्तकर्ता है ।
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
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