Bedingte Knockdown von Genexpression in Krebs-Zell-Linien, die Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung zu studieren
Summary
Dieses Protokoll dient eine Regelung für die Einrichtung eines funktionalen Tet-ON Systems in Krebszelllinien und seine spätere Verwendung, insbesondere für die Untersuchung der Rolle der Tumor Zelle abgeleitet Proteine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung.
Abstract
SiRNA und ShRNA-vermittelten niederzuschlagen (KD) Methoden der Genexpression regulieren sind wertvolle Werkzeuge für das Verständnis der Funktion der Gene und Proteine. Jedoch in dem Fall, dass das KD des Proteins des Interesses eine tödliche Wirkung auf Zellen hat oder die erwartete Wirkung der KD ist sind zeitabhängig, bedingungslose KD-Methoden nicht geeignet. Bedingte Systeme eignen sich eher in diesen Fällen und das Thema von großem Interesse gewesen. Dazu gehören Ecdyson-induzierbaren Überexpression Systeme, Cytochrom P-450 Induktion System1, und die Tetracyclin reguliert gen Expressionssysteme.
Das Tetracyclin reguliert gen Ausdruck System ermöglicht reversible Kontrolle über Protein-Expression durch Induktion der ShRNA Ausdruck im Beisein von Tetracyclin. In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit funktionalen Tet-ON System im menschlichen Krebszelllinien für bedingte Regulation der Genexpression. Dann zeigen wir den Einsatz dieses Systems in der Studie von Tumor-Zelle-Monocyte-Interaktion.
Introduction
Tumor verbunden sind Makrophagen (TAMs) tragen zur Tumorentstehung durch die Förderung von Tumorwachstum und Metastasierung regulieren die Immunantwort2. Krebszellen Rekrut entzündliche Monozyten, die Tumor zu infiltrieren und Pro-tumorigenic TAMs3differenzieren. Infiltration des Tumors mit TAMs korreliert mit schlechten klinischen Verlauf und die immunsuppressive Rolle der Makrophagen4,5verbunden worden. Allerdings sind die Mechanismen der Rekrutierung von Makrophagen an den Tumor nicht gut erforscht und ein besseres Verständnis der beteiligten Bahnen ist entscheidend für die Weiterentwicklung des Feldes und vielversprechende Therapien. Eine der Herausforderungen bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und normalen Zellen im Tumor Mikroumgebung (TME) ist die Komplexität der Mechanismen und Zellen beteiligt, in-vitro- Ansätze, die Präparation der das Übersprechen zu ermöglichen. Hier präsentieren wir eine vielseitige Methode, die angewendet werden kann, um parakrine Wirkung von einem Krebs Zelle abgeleitet, sekretierten Proteine über die Migration von anderen Zelltypen wie Makrophagen, in Vitrozu untersuchen. Mit einem System, wo ist der Ausdruck der ShRNA gegen ein Krebs Zelle abgeleitete Protein beteiligt bei der Rekrutierung von Monozyten unter der Kontrolle des Tetracyclin induzierbaren Promotors, ist die parakrine Wirkung des sekretierten Proteins auf Monozyten quantitated. In diesem Protokoll folgte Klonen von ShRNA Sequenzen in der Tetracyclin-regulierten Vektor vorgestellt Generation der stabilen Krebszelllinien. Darüber hinaus die Reinigung des primären menschlichen Monozyten und eine Boyden Kammer Assay werden verwendet, um die parakrine Wirkung eine Krebszelle abgeleitete Protein zur Migration von Monozyten zu analysieren.
Herunterregulierung des Proteins Kodierung Gene wird häufig mit SiRNA und ShRNA Techniken, wenn auch nicht ohne Einschränkungen in der Verwendung angewendet. Der langfristigen Knock-Down (KD) von Genen kann sekundäre adaptive Reaktion der Zellen hervorrufen, die experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen. Fehlende zeitliche Kontrolle der Genexpression macht es schwierig, die dynamische Rolle eines Proteins über die Zeit oder die Rolle eines Proteins entscheidend für das Überleben der Zellen zu studieren. Dieses Problem ist besonders wichtig in in-Vivo -Einstellungen, wo möglicherweise die Rolle eines Proteins in Tumorentstehung und Progression Downregulation des Ausdrucks des Proteins des Interesses erforderlich, nur nach Tumor festgestellt wird. Bedingte KD hat den Vorteil, verhindern eine zu frühe tödliche Wirkung von der KD auf Zellen und Analyse der Rolle des Proteins in verschiedenen Phasen des Tumorwachstums, zu ermöglichen, während bedingungslose KD mangelnde Entwicklung von Tumoren führen kann.
Eine Reihe von bedingten KD-Systeme wurden entwickelt, um die Einschränkungen des stabilen KD zu beheben. Die bedingte gen Expressionssysteme gehören Ecdyson-induzierbaren Überexpression Systeme, Cytochrom P-450 Induktion System1und Tetracyclin reguliert gen Expressionssysteme. Die Tetracyclin-regulierte Gene Expressionssysteme ermöglichen Steuerung Ausdruck der ShRNA nach Zugabe von Antibiotika Tetracyclin (oder seine stabiler analog – Doxycyclin). In Tet-ON Systemen, der Ausdruck der ShRNA induziert wird, in Anwesenheit von Tetracyclin/Doxycyclin, wodurch eine Genexpression KD, während in Tet-OFF-Systeme, ist der Ausdruck der ShRNA in Anwesenheit von Tetracyclin, wodurch in der Genexpression unterdrückt. Ein Nachteil von Tetracyclin-induzierbaren Systems ist bereits berichtet niedrigen Ebenen des Ausdrucks der ShRNA in Ermangelung von Doxycyclin – so genannte Undichtigkeit6,7. In der Tet-beschrieben System hier, bei der Verabreichung von Tetracyclin, die Bindung des konstitutiv exprimierten Tetracyclin Repressor (TetR) Protein auf die Tet-responsive Element (TRE) Sequenz innerhalb der H1 Promotorregion ShRNA von Interesse ist unterdrückt. Dies führt zu Ausdruck der ShRNA und Hemmung der Übersetzung des Proteins des Interesses an einem Tetracyclin-abhängigen Weise8,9.
Andere verfügbare Tet-ON-Systeme umfassen gleichzeitige Knock-in der die Sequenz zwischen TATA-Box und proximalen Sequence-Element (PSE) und TATA-Box und Transkription starten Website entwickelt von Chan Et al.TetO. 10 dieses System erfordert weniger toxische Dosen von Tetracyclin, ShRNA Ausdruck, jedoch unter einer nicht-induzierte Zustand zu regulieren niedrige Niveaus der ShRNA ausgedrückt werden. Der Krüppel-assoziierten Feld (Krabbe) basierte Tet-ON System11 enthält KRAB, ein Zink-Finger-Protein, das Themen Gene innerhalb eines Bereichs von 3 kb der KRAB Bindungsstelle transcriptional Unterdrückung gelegen. Chimäres Protein tTRKRAB TetO binden kann, und aufgrund der großen Palette von DNA steuerbare Kapazität, TetO brauchen nicht zwischen die Transkription zu Website und dem Projektträger zu starten und haben geringe Auswirkungen auf die Aktivität des Veranstalters. Unter den nicht-induzierte Zustand wurde diese steuerbare RNA Interferenzsystem berichtet, zeigen ein geringeres Maß an undichten Ausdruck der ShRNA11,12; Es erfordert jedoch einen sequenziellen, zwei-Vektor klonen Ansatz. Im Vergleich zu vorher entwickelten bedingte KD-Systeme wie z. B. die Ecdyson-induzierbaren Überexpression oder Cytochrom P-450 Induktionssystem das Tetracyclin-regulierten System hat den Vorteil, seine Robustheit und Reversibilität und ist daher die am häufigsten verwendeten routinemäßig System13. Das System verwendet in diesem Protokoll hat den Vorteil gegenüber dual TetO Knock-in-System und KRAB Tet-ON System, wie es erfordert, geradlinig, einzelne Vektor klonen, ermöglicht schnelle Erzeugung von mehreren Klonen, und es sehr geringe Undichtigkeit in zeigt der das Fehlen von Doxycyclin.
TME ist entscheidend für die Entstehung von Krebs. Zur Erleichterung der Tumorwachstum rekrutieren Krebszellen entzündliche Monozyten durch Sekretion chemotaktische Proteine. Rekrutierte Monozyten des Tumors zu infiltrieren und differenzieren in Pro-tumorigenic TAMs, die Tumorwachstum und Metastasierung beitragen. In-vitro- Studien der Immunzelle Rekrutierung nutzen Migration Assays, mit Boyden Kammer Assay wird weithin verwendet14,15,16,17. In diesem Test wird die Lockstoffgradient Protein-Quelle, z. B. Krebszellen oder ein gereinigtes Protein, in der unteren Kammer platziert. Immunzellen befinden sich in der oberen Kammer durch poröse Membran aus dem unteren Fach getrennt. Zellen, die Migration auf die zunehmende Neigung der Lockstoffgradient, und auf der unteren Seite der Membran sind fleckig und unter dem Mikroskop ausgezählt. Hier testen wir die Lockstoffgradient Funktion des Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) auf Monozyten durch die Generierung von stabilen, induzierbaren Krebszelllinien, wo Doxycyclin Zusatz Expression von PAI-1 geregelt ist. Wir verwenden menschliche primäre Monozyten in der Boyden Kammer Migration Test zu um beurteilen, die Rolle des PAI-1 Monocyte Migration. Unterschiede zwischen primären menschlichen Monozyten und weit verbreiteten monozytären Zelllinien wie THP1 berichtet worden und umfassen verschiedene Cytokine Ausdruck Muster18; z. B. 5-10 fache Erhöhung der TNF-α Ausdruck von THP1 Zellen gegenüber menschlichen Monozyten19. THP1 Zellen menschlichen Leukämie monozytären Zellen abgeleitet sind, sind leicht zu pflegen und vermehren sich mit durchschnittlich Verdopplungszeit von 19-50 h20. Im Gegenteil, sind menschlichen Monozyten gekennzeichnet durch eine kurze Lebensdauer in der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren. Da Monozyten aus Blut von Spendern, gereinigt sind eine ganze Menge Variabilität tritt zwischen den Individuen und abhängig von der Methode der Reinigung, kann Verunreinigungen mit anderen Zelltypen entstehen. Jedoch primäre Monozyten relevant sind und es wird empfohlen, verwenden oder mit der monozytären Zelllinien mit primären Monozyten in biologischen Forschung19erzielten Ergebnisse bestätigen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung der menschlichen primäre Monozyten aus dem peripheren Blut. Alternative Methoden der Monocyte Reinigung gehören Dichte-Gradienten und Haftung-Protokolle und zwei-Schritt-Verfahren mit einzelnen Steigungen von Ficoll-Hypaque gefolgt von einer Percoll gradient21. Die Reinheit der Monocyte Bevölkerung durch diese Methoden schwankt zwischen 70-90 % erhalten. Die hier beschriebene Methode verwendet ein Dichtegradient, gefolgt von einer negativen Auslese immun22 und ermöglicht die Reinigung des menschlichen Monozyten ohne direkten Kontakt mit Antikörpern, damit ihre versehentliche Aktivierung zu vermeiden und was ein > 95 % reines Bevölkerung von Monozyten.
Das Protokoll hier vorgestellten dient zur Errichtung eines funktionalen Tet-ON Systems Genexpression KD in menschlichen Krebszelllinien, um die Lockstoffgradient Wirkung des Krebs-abgeleitete sekretierten Proteins PAI-1 auf Monozyten zu studieren. PAI-1 ist durch eine Vielzahl von Tumoren überexprimiert und seinen Ausdruck paradoxerweise korreliert mit schlechten klinischen Verlauf23,24. Die Pro-tumorigenic Rolle des PAI-1 ergibt sich aus seiner Pro-angiogenen und Anti-apoptotische Funktionen25,26. PAI-1 hat sich gezeigt, zu einer Entzündung durch Förderung der Rekrutierung von Makrophagen an den Ort der Entzündung27beizutragen. PAI-1 zeigte, glatte Muskulatur Cellmigration28,29 zu fördern und zur Teilnahme an der Mac-1 abhängige Makrophagen Migration30. PAI-1-Überexpression nachweislich auch Rekrutierung von Raw 264,7 Makrophagen in B16F10 Melanom Tumoren31deutlich zu verbessern. Jedoch wurde die Rolle des PAI-1 in TAM Migration nicht im Detail untersucht. Wir verwenden das beschriebene Protokoll beantworten die Frage, ob PAI-1 Monozyten zu Krebszellen zieht. Diese Methodik ermöglicht Dissektion der das Übersprechen zwischen Tumor und TME durch die sekretierten Proteine in Krebszellen zum Schweigen zu bringen und die Komponenten von der TME analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bestehend aus einer Vielzahl von Zelltypen, ist die TME entscheidend für die Entstehung von Krebs. Um optimale Wachstumsbedingungen zu ermitteln, ziehen die Krebszellen Monozyten durch Sekretion von chemotaktische Faktoren. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Studium des Mechanismus der Monocyte Rekrutierung von Tumor Zellen in Vitro. Zu diesem Zweck wird eine Kombination von induzierbaren gen Expressionssystems, Reinigung des primären menschlichen Monozyten und als Beispiel für eine Migration Assay…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Jacqueline Rosenberg für Korrekturlesen Manuskript anerkennen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das US Department of Health And Human Services/National Institutes of Health mit einem Zuschuss zu YA DeClerck (gewähren 5R01 CA 129377) und der TJ Martell Foundation. MH Kubala ist der Empfänger eines Research Karriere Entwicklung Fellowship Award des Saban Research Institute am Kinder Hospital Los Angeles.
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
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