Denne publikation beskriver fabrikation af en orgel-on-chip enhed med integreret elektroder til direkte kvantificering af transendothelial elektrisk modstand (TEER). For validering, blod – hjerne barrieren var efterlignede inde denne mikrofluid enheden og dens barriere funktion blev overvåget. De præsenterede metoder til elektrode integration og direkte TEER kvantificering er generelt gældende.
Organer på chips, in vitro- modeller der involverer kultur af (menneskelige) væv inde i mikrofluid enheder, er hurtigt opstå og løfte om at give nyttig forskning værktøjer til at studere menneskers sundhed og sygdom. For at karakterisere den barriere funktion af cellelag kulturperler inde orgel-on-chip enheder, måles ofte transendothelial eller transepithelial elektrisk modstand (TEER). Med henblik herpå integreres elektroder normalt i chippen ved micromachining metoder at give mere stabile målinger end opnås med manuel indsætning af elektroder i indløb af chippen. Men disse elektroder ofte hæmmer besigtigelse af de undersøgte cellelag eller kræver dyre renrum processer for fabrikation. For at overvinde disse begrænsninger, indeholder den enhed, der beskrives her fire nemt integreret elektroder, der er placeret og fast uden for området kultur, gør besigtigelse muligt. Brug af disse fire elektroder modstand af seks måling stier kan kvantificeres, hvorfra TEER kan være direkte isoleret, uafhængig af modstanden i dyrkningsmediet-fyldt microchannels. Blod – hjerne barrieren blev replikeret i denne enhed og dens TEER blev overvåget for at vise enhed anvendelighed. Denne chip, de integrerede elektroder og TEER bestemmelse metode er generelt gældende i organer-på-chips, både til at efterligne andre organer eller til at indgå i eksisterende orgel-on-chip systemer.
Organer på chips hurtigt frem som en ny og lovende klasse af in vitro- væv modeller. 1 i disse modeller er celler kulturperler inde mikrofluid enheder, der er manipuleret på en sådan måde, at de efterligner de fysiologiske mikromiljø af disse celler. 1 , 2 dette resulterer i mere realistisk fysiologiske eller patologiske adfærd af disse celler end kan forventes fra konventionelle in vitro- modeller af simple design og grundlæggende funktion. 3 , 5 , 6 Derudover organer på chips giver en bedre kontrollerbare miljø end i vivo modeller og kan optage både raske og syge væv af human oprindelse trofast replikere både menneskets fysiologi og patologi. De seneste opsummerede fremskridt i udviklingen af blod – hjerne barrierer på chips (BBBs på chips) viser, at feltet er hurtigt bevæger sig fremad. 7
En anden fordel af organer på chips er, at de aktiverer real-time og kontinuerlig overvågning af væv kulturperler inde i enheden af mikroskopi, on-line biokemiske analyser og integrerede sensorer. 1 , 2 For eksempel, måling af transendothelial eller transepithelial elektrisk modstand (TEER) er en kraftfuld metode til at overvåge ikke-invasivt udvikling og afbrydelse af barriere-dannende væv. 8 , 9 , 10 TEER er den elektriske modstand på tværs af en cellulær barriere og er derfor vejledende barriere integritet og permeabilitet. 10 i organer på chips, cellulære barrierer er generelt kulturperler på en membran, der adskiller to fluidic kanaler, der repræsenterer den apikale og basolateral rum af denne barriere væv. I sådanne chips kan TEER målinger udføres bekvemt med elektroder indsat i indgange og udgange af de to kanaler. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 men manuel indføring og genindførelse af elektroderne kan nemt medføre placering fejl og dermed variationer i den målte modstand som f.eks. forskelle i modstanden i længere eller kortere stier gennem microchannels væsentlig er sammenlignet med den celle barriere modstand. 16 for at eliminere genindsætter fejl, enheder med integreret elektroder er blevet foreslået. Men de fleste af disse integrerede elektroder blokere visningen Når inspicerende vævskultur17,18,19,20,21 og/eller kræver specialiseret renrummet processer for fabrikation. 17 , 22
Orgel-on-chip-enhed, der beskrives i denne publikation, først anvendte i en tidligere publikation,16 kombinerer stabilitet af integrerede elektroder med synlighed på den målte cellelag og let fabrikation. Design og fabrikation af denne chip er afbildet i figur 1. Kort sagt, denne enhed består af to dele, Polydimethylsiloxan (PDMS) med kanal aftryk, der er fæstnet sammen lækage-fri med en polycarbonat membran med 0,4 µm porer i mellem. Fire platin wire elektroder er indsat og fast på plads med et photocurable klæbestof godt uden for området kultur. Alle disse fabrikation trin kan udføres med almindelige laboratorieudstyr, uden behov for et renrum miljø. Oven i dette, seks impedans målinger kan gøres ved hjælp af disse fire elektroder, hvorved direkte isolation af de målte TEER, uafhængigt af modstanden af microchannels fører op til tværsnit og dermed minimere påvirkning af ikke-biologiske variationer i system som (re) indsættelse fejl. 16
At vise anvendeligheden af denne enhed og de direkte TEER målinger, blod – hjerne barrieren (BBB) blev replikeret i denne chip. Denne biologiske barriere består af specialiserede endotelceller og regulerer transport mellem blod og hjerne til at give hjernen homøostase. 23 , 24 for at efterligne BBB, den øverste kanal af mikrofluid enheden var foret med menneskelige cerebral mikrovaskulære endotelceller fra linjen hCMEC/D3 celle (venligst leveret af Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, Frankrig). 25 den præsenterede metode er, men mere generelt gælder for enhver orgel-on-chip enhed med to rum, gør det muligt direkte TEER bestemmelse ved hjælp af let integreret elektroder.
I dette manuskript, er først fabrikationsproces af orgel-on-chip-enhed med integreret elektroder beskrevet. Næste, seeding procedure og kultur i endothelial hjerneceller inde i enheden er forklaret, samt på chip TEER målinger. I afsnittet resultater repræsentative TEER målinger er vist og databehandling er afklaret. Endelig præsenteres den barriere funktion af den BBB-on-chip, overvåges i løbet af 3 dage, viser anvendeligheden af præsenteret enhed og metoder til at overvåge TEER.
I dette manuskript, blev engineering af et orgel-on-chip enhed og direkte bestemmelse af transendothelial elektrisk modstand (TEER) af en cellulær barriere kulturperler i enheden præsenteret. Metoden præsenteres af integrere elektroder uden renrum udstyr og direkte TEER bestemmelse ved hjælp af fire elektroder er relevant for enhver orgel-on-chip enhed med to mikrofluid rum. Chip layout og geometri kan tilpasses kravene i de forestiller sig eksperimenter, så længe de fire elektroder er adskilt i to rum. De fire elektroder kan selv bekvemt indsættes i fjorde eksisterende chips, forudsat at de er fikseret i stedet for varigheden af seks målinger. Lækage-fri bonding metode kan være optimeret til forskellige membraner og kanal geometrier ved at ændre PDMS/toluen forholdet. Et højere indhold af toluen resulterer i en tyndere spin-belagt lag af mørtel26 og kan være mere egnet til mere lavvandede og smallere kanaler i PDMS dele. En lavere toluen indhold resulterer i en tykkere mørtel lag26 og kan være mere egnet til at omslutte tykkere membraner mellem PDMS dele.
Som det kan ses i de skematiske impedans spektre i figur 2A og de eksperimentelle spektre i figur 2E og 2F, påvirkes impedans målinger af dobbelt lag kapacitans på grænsefladen elektrode-medium. På grund af den lille størrelse af elektroder inde i microchannels, kan dobbelt lag kapacitans dominere over resistive plateauet i den cellulære barriere i impedans spektre, komplicerende kvantificering af TEER. For at overvinde dette, elektroderne kan indsættes yderligere i kultur-kanaler før fiksering. Dette vil øge overfladearealet af elektroden udsat til substratet og med det dobbelt lag kapacitans vil stige så godt. Dette resulterer i en forskydning af den kapacitive skråning til lavere frekvenser, således at resistive plateauet i den cellulære barriere kan være mere let anerkendte og kvantificeret. Selvom modstanden i den målte sti mellem to elektroder bliver mindre, vil dette ikke påvirke TEER kvantificering efter metoden præsenteres.
Mens måling gennem den cellulære barriere, er det muligt, at den ekstra resistive plateau ikke kan genkendes. Dette kan være resultatet af en fluidic forbindelse mellem de to kanaler, for eksempel hvis membranen er dårligt afgrænses af mørtlen, fører til et målte sti rundt den cellulære barriere. Derudover kan der elektriske bridging udenfor chippen hvis elektroderne forbindes af en dråbe af næringssubstratet. Dette er normalt kombineret med en lavere målte impedans og kan løses ved at fjerne denne bro af næringssubstratet. Endelig, hvis der er ingen resistive plateau og den målte impedans er størrelsesordener højere end forventet, kan der være en løs forbindelse i den elektriske ledninger eller på strømkilden.
I fremtiden, kan fysiologiske relevansen af de nuværende BBB-on-chip øges ved at udsætte i endothelial celler til at shear stress på fysiologiske niveauer, som er rapporteret til at fremme BBB differentiering og stigning barriere tæthed og er svært at opnå i konventionelle in vitro- modeller. 29 derudover den nederste kanal præsenteres enhedens giver et egnet rum til hjerne-afledte celler til at være co kulturperler med endotelet. Det forventes også at øge den barriere funktion og giver også mulighed for undersøgelse af det komplekse samspil mellem relevante celletyper patologiske betingelser. 29
Afslutningsvis, orgel-on-chip-enhed, der beskrives i denne publikation kan være opdigtet benytter standard laboratorieudstyr og er vist at give direkte TEER målinger ved hjælp af fire integrerede elektroder, der ikke hindrer besigtigelse af cellen studerede lag. Anvendeligheden af denne enhed i feltet organer på chips blev demonstreret ved at efterligne BBB i denne chip og overvåge TEER periode kultur. Et væld af andre (barriere) organer kan efterlignes ved at medtage andre relevante celletyper i denne chip. Derudover kan metode til måling af TEER let anvendes i andre to rum-baserede orgel-on-chip enheder til ankommer reproducerbare og meningsfuld TEER værdier, der kan sammenlignes på tværs af enheder og systemer.
The authors have nothing to disclose.
Vi parlamentsarbejdet Johan Bomer for fabrikation af mug og Mathijs Bronkhorst for frugtbare drøftelser og bistand med data repræsentation.
Denne forskning er finansieret af: SRO biomedicinske Microdevices af L.I. Segerink, MIRA Institut for Biomedicinsk teknik og tekniske medicin, universitetet i Twente; SRO organer-på-Chips af A.D. van der Meer, MIRA Institut for Biomedicinsk teknik og tekniske medicin, universitetet i Twente; og VESCEL, ERC Advanced Grant A. van den Berg (grant nr. 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |