जन अलगाव और इन विट्रो में खेती के Intramolluscan चरणों की मानव रक्त अस्थाई Schistosoma Mansoni
Summary
इस अनुच्छेद के बड़े पैमाने पर axenic अलगाव और मानव रक्त अस्थाई Schistosoma mansoni और उनके परिचय के लिए इन विट्रो संस्कृति में बाद में प्रसंस्करण के मुक्त तैराकी miracidia के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है ।
Abstract
मानव रक्त flukes, Schistosoma एसपीपी., एक जटिल जीवन चक्र है कि एक घोंघा मध्यवर्ती और स्तनधारी अंतिम मेजबान, क्रमशः के भीतर अलैंगिक और यौन विकास के चरणों शामिल है । को अलग करने और बनाए रखने के इन विट्रो संस्कृति शर्तों के तहत विभिंन जीवन चक्र चरणों के लिए क्षमता बहुत सेलुलर, जैव रासायनिक और आणविक तंत्र की जांच की सुविधा है परजीवी विकास, विकास और मेजबान विनियमन बातचीत. schistosomiasis के संचरण अलैंगिक प्रजनन और घोंघा मेजबान के भीतर कई लार्वा चरणों के विकास की आवश्यकता है; संक्रमित miracidium से, प्राथमिक और माध्यमिक sporocysts के माध्यम से, अंतिम cercarial चरण है कि मनुष्यों को संक्रमित है । इस पत्र में हम बड़े पैमाने पर सेने और संक्रमित चूहों के जिगर से प्राप्त अंडे से Schistosoma mansoni miracidia के अलगाव के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल मौजूद है, और इन विट्रो संस्कृति में उनके बाद में परिचय । यह प्रत्याशित है कि विस्तृत प्रोटोकॉल नए शोधकर्ताओं को प्रोत्साहित करने में संलग्न है और schistosome अनुसंधान के इस महत्वपूर्ण क्षेत्र को व्यापक होगा ।
Introduction
मानव रक्त flukes Schistosoma एसपीपी., schistosomiasis की प्रेरणा का एजेंट हैं, एक उपेक्षित उष्णकटिबंधीय एक अनुमानित २३०,०००,००० लोगों को दुनिया भर में पीड़ित एक बीमारी1। सबसे व्यापक प्रजातियों, Schistosoma mansoni, भौगोलिक दृष्टि से दक्षिण अमेरिका में वितरित किया जाता है, कैरेबियन द्वीपसमूह, मध्य पूर्व और उप सहारा अफ्रीका2। एस mansoni, और अंय schistosomes के जीवन चक्र, जटिल है, एक स्तनधारी निश्चित मेजबान और जीनस Biomphalaria के मीठे पानी घोंघे शामिल है कि बाध्य मध्यवर्ती मेजबान के रूप में काम करते हैं ।
mansoni पुरुष और मादा वयस्क कृमि जोड़े स्तनधारी मेजबान के पीछे mesenteric नसों में रहने वाले जोड़, embryonated अंडे की रिहाई में जिसके परिणामस्वरूप (ओवा) कि आंतों की श्लेष्मा झिल्ली के छोटे venules में दर्ज हो जाते हैं । अंडे तो पोत दीवारों के माध्यम से टूटता है, श्लैष्मिक ऊतक के माध्यम से विस्थापित, और अंततः आंतों लुमेन जहां वे मल के साथ voided है दर्ज करें । जब ओवा मीठे पानी में प्रवेश और मुक्त तैराकी लार्वा (miracidia) हैच, वे छोटे क्रम में, अपने जीवन चक्र जारी रखने के क्रम में संक्रमित करने के लिए एक उपयुक्त Biomphalaria घोंघा खोजने चाहिए । इस संक्रमण प्रक्रिया सक्रिय प्रवेश और मेजबान में लार्वा की प्रविष्टि के बाद घोंघा के बाहरी शरीर की सतह के लिए miracidial लगाव शामिल है । प्रवेश के तुरंत बाद, miracidium अपनी बाहरी oleraceum एपिडर्मल प्लेटें शेड शुरू होता है के रूप में यह एक syncytium कि नई बाहरी सतह अगले नलिकाकार चरण के (लार्वा), प्राथमिक या मां sporocyst बन जाएगा रूपों । अलैंगिक प्रजनन के माध्यम से, प्रत्येक प्राथमिक sporocyst उत्पादन और sporocysts की दूसरी पीढ़ी विज्ञप्ति, माध्यमिक या बेटी sporocysts, जो बारी में, उत्पंन और अंतिम intramolluscan चरण के बड़ी संख्या में जारी, cercaria3 . घोंघा मेजबान से बचने पर, मुक्त तैराकी cercariae को संलग्न करने में सक्षम है और सीधे एक मानव या अंय उपयुक्त स्तनधारी मेजबान की त्वचा मर्मज्ञ । अपने नए मेजबान में प्रवेश पर, cercariae परजीवी schistosomula मंच को बदलने और संवहनी प्रणाली पर आक्रमण । वे, बारी में, फेफड़ों की ओर पलायन और फिर यकृत नस जहां वे वयस्क कीड़े, फार्म पुरुष और महिला जोड़े को परिपक्व और mesenteric नसों यात्रा करने के लिए अपने जीवन चक्र को पूरा करने के लिए ।
सफल intramolluscan या “घोंघा चरण” लार्वा schistosomes के विकास के लिए मानव की मेजबानी के चक्र के निरंतरता के लिए आवश्यक है के लिए मेजबान संचरण । महत्वपूर्ण महत्व के नि: शुल्क के प्रवेश की अवधि है घोंघा मेजबान में miracidium तैराकी और प्राथमिक sporocyst चरण के लिए अपनी प्रारंभिक परिवर्तन । शारीरिक और प्रतिरक्षा मेजबान और परजीवी के बीच अनुकूलता पर निर्भर करता है, यह लार्वा विकास के इस चरण के दौरान है कि प्रारंभिक सफलता या संक्रमण स्थापित करने के लिए विफलता निर्धारित है4,5,6 . प्राथमिक sporocysts माध्यमिक sporocysts, जो तब मानव-संक्रामक cercariae उत्पन्न उत्पादन में सक्षम asexually के बाद के विकास, आगे एक स्वतंत्र शारीरिक मेजबान पर्यावरण कि परजीवी के विकास के सभी के लिए प्रदान करता है की आवश्यकता होती है और प्रजनन की जरूरत है ।
तारीख करने के लिए, थोड़ा अंतर्निहित शारीरिक, जैव रासायनिक और आणविक प्रक्रियाओं schistosome-घोंघा बातचीत को नियंत्रित करने, विशेष रूप से अणुओं और लार्वा विकास और प्रजनन, या नियमन में शामिल रास्ते के बारे में जाना जाता है मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं । इन विट्रो संस्कृति की स्थिति है कि प्रयोगात्मक हेरफेर की अनुमति बहुत विकास के रास्ते और कोशिका विकास के अंतर्निहित तंत्र की खोज की सुविधा होगी के तहत इन लार्वा चरणों की बड़ी संख्या के लिए तैयार उपयोग, भेदभाव और प्रजनन । महत्वपूर्ण परजीवी रास्ते या तंत्र, इन विट्रो प्रयोग के माध्यम से की पहचान की, तो लार्वा विकास को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है/घोंघा मेजबान में प्रजनन, या घोंघा मेजबान प्रतिरक्षा मांयता और उंमूलन में शामिल तंत्र की पहचान miracidial या sporocyst अवस्था.
इस लेख और वीडियो प्रस्तुति में, हम में परिचय के लिए नि: शुल्क तैराकी एस mansoni miracidia की बड़ी संख्या को अलग करने के लिए एक विधि का विस्तृत विवरण प्रदान इन विट्रो संस्कृति है कि तब अनुवर्ती प्रयोगात्मक अप करने के लिए अधीन हो सकता है हेरफेर (देखें चित्रा 1 प्रोटोकॉल कार्यप्रवाह के एक योजनाबद्ध अवलोकन के लिए) । हालांकि इसी तरह की प्रक्रियाओं पहले7वर्णित किया गया है,8,9, हमें लगा कि एक विस्तृत प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं जो इस मॉडल को काम करने के लिए अभी भी अनुत्तरित सवालों का पता करने के लिए इच्छा के लिए उपयोगी होगा intramolluscan लार्वा विकास, सेलुलर प्रसार, और schistosome-घोंघा प्रतिरक्षा बातचीत । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण आसानी से ऐसे मूत्राशय के रूप में अंय चिकित्सकीय महत्वपूर्ण trematodes से अंडे के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है एस haematobium, जिगर flukes या फेफड़ों flukes ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Miracidia एस mansoni, अलग और हेरफेर के रूप में यहां वर्णित है, केवल घोंघा मध्यवर्ती मेजबान को संक्रमित कर सकते हैं, और इसलिए लार्वा विकास के इस चरण के दौरान एक मानव के लिए खतरा नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं । हालां?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH अनुदान RO1AI015503 द्वारा भाग में वित्त पोषित । Schistosome-संक्रमित चूहों को NIH संसाधनों के माध्यम से वितरण के लिए NIAID-HHSN272201000005I अनुबंध कवठेकर के माध्यम से जैव चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (रॉकविल, MD) में NIAID Schistosomiasis रिसोर्स सेंटर द्वारा प्रदान किए गए.
Materials
| Chernin's balanced salt solution (CBSS+) | For 1L of solution | ||
| 2.8 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Dissolve salts, except calcium chloride, and |
| 0.15 g of potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | sugars in 800 mL ddH2O |
| 0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous | Fisher Scientific | S374-500 | Dissolve calcium chloride separately in 200 |
| 0.45 g magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | mL ddH2O |
| 0.53 g calcium chloride dihydrate | Mallinckrodt | 4160 | Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with |
| 0.05 g sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | with constant mixing |
| 1 g glucose | MP Biomedicals | 152527 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a |
| 1 g trehalose | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 µm disposable bottle-top filter |
| 10 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add filtered penicillin and streptomycin soln prior use |
| Incomplete Bge medium (Ibge) | For 900 mL solution | ||
| 220 mL Schneider’s Drosophila medium modified | Lonza | 04-351Q | Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O |
| 4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | L9010 | Add lactalbumin hydrolysate and galactose |
| 1.3 g galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter |
| Complete Bge medium (cBge) | For 100 mL of solution | ||
| 90 mL Incomplete Bge medium | To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in | ||
| 9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) | Atlanta Biologicals | S12450 | waterbath at 60°C for 1 hr while gently |
| 1 mL 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | swirling the bottle every 10 min Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes and store at -20°C. Mix medium + FBS and filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter Add penicillin and streptomycin prior to use |
| Pond water (stock solution) | 1L of stock solution | ||
| 12.5 g calcium carbonate | Fisher Scientific | C64-500 | Mix all salts in 1L of ddH2O |
| 1.25 g magnesium carbonate | Fisher Scientific | M27-500 | Note that the salts will not have completely |
| 1.25 g sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | dissolved. Shake vigorously to suspend |
| 0.25 g potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | salts prior to making the working soln |
| Pond water (working solution) | 1.5L of solution | ||
| 0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in | Mix stock to ddH2O | ||
| 1500 mL of ddH2O | Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle) | ||
| 1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Saline solution (1.2% NaCl) | 1.5L of solution | ||
| 18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave saline solution to sterilize |
| 1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin | Hyclone | SV30010 | Add penicillin and streptomycin prior use |
| Additional equipment and material: | |||
| 7-L mouse euthanizing chamber | Following approved IACUC protocol no. V001551 | ||
| Mice | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine | |
| CO2 tank and regulator | pathogen-free | ||
| 24-well tissue culture plate | TPP | 92424 | |
| 1-L volumetric flasks | |||
| Light source (150W) | Chiu Tech Corp | Model F0-150 | |
| Centrifuge, refrigerated, swinging bucket | Eppendorf | Model 5810R | |
| Centrifuge bottles (250 mL) | Nalgene | ||
| 15-mL centrifuge tubes, sterile | Corning | 430053 | |
| Sterile disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 1371120 | |
| 0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| Stainless steel blender | Waring Commercial | Model 51BL31 | |
| Blender cup, 100 mL capacity | Waring Commercial | ||
| Inverted compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE300 |
Riferimenti
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