Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in<em> Drosophila</em> Embryonen
Summary
Wir beschreiben hier einen Phagozytose-Assay unter Verwendung der dispergierten embryonalen Zellen von Drosophila . Es ermöglicht uns, in vivo Phagozytose Ebenen einfach und präzise zu quantifizieren und neue Moleküle zu identifizieren, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erforderlich sind.
Abstract
Die molekularen Mechanismen, die der Phagozytose von apoptotischen Zellen zugrunde liegen, müssen aufgrund ihrer Rolle bei immunen und entzündlichen, nicht beherrschbaren Krankheiten genauer aufgeklärt werden. Wir haben hier eine experimentelle Methode entwickelt, um die Phagozytose quantitativ unter Verwendung der Fruchtfliege Drosophila zu untersuchen , bei der das Gennetz, das die Verschlingungsreaktionen kontrolliert, evolutionär von Säugetieren konserviert wird. Um die Phagozyten mit ganzen Tieren genau zu erfassen und zu zerlegen, wurden Drosophila- Embryos homogenisiert, um dispergierte Zellen einschließlich Phagozyten und apoptotischen Zellen zu erhalten. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, in vivo Phagozytose Ebenen zu messen, als ob wir einen in vitro Phagozytose-Assay durchgeführt haben, in dem es möglich ist, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen zu beobachten und genau das Niveau der Phagozytose zu quantifizieren. Wir bestätigten, dass diese Methode die früheren Studien wiedergibtDie die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen benötigten Gene identifizierten. Diese Methode erlaubt es, die Verschlüsselung von toten Zellen zu analysieren und in Kombination mit der mächtigen Genetik von Drosophila die komplexen phagozytischen Reaktionen aufzudecken, die die Migration, die Erkennung, die Verschlußung und den Abbau von apoptotischen Zellen durch Phagozyten umfassen.
Introduction
In Metazoan-Tieren, z. B. die Nematoden Caenorhabditis elegans , die Fruchtfliege Drosophila melanogaster und Mäuse und Menschen, eine große Anzahl von Zellen unterziehen Apoptose während der Entwicklung, um ihre Körper und im Erwachsenenalter zu pflegen Homöostase 1 , 2 . Apoptotische Zellen müssen schnell entfernt werden, weil sie eine Entzündung in den umliegenden Geweben durch Freisetzung von immunogenen intrazellulären Materialien induzieren, wenn sie nicht vollständig entfernt werden 3 . Um die schnelle Entfernung zu erleichtern, stellen apoptotische Zellen so genannte eat-me-Signale dar, die von den Engulfierungsrezeptoren von Phagozyten erkannt werden und durch Phagozytose 3 , 4 , 5 , 6 eliminiert werden. So spielt die Phagozytose eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Wirtshomöostase und damit der Aufklärung des Moleküls Die der Phagozytose von apoptotischen Zellen zugrunde liegen, ist von Bedeutung.
Die Mechanismen , die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erscheinen evolutionär zwischen den Arten in den Nematoden, Fliegen und Mäuse 7 konserviert werden. Mehrere Phagozytose-Assays sind derzeit verfügbar, um die Verschlußung von apoptotischen Zellen in diesen Modelltieren zu beurteilen. In C. elegans werden 131 somatische Zellen während der Entwicklung einem programmierten Zelltod unterzogen, und Zellkerzen werden durch benachbarte Zellen phagozytiert, die nicht professionelle Phagozyten sind 8 . So zeigt das Zählen der Anzahl der verbleibenden Zellleichen in C. elegans den Grad der Phagozytose in vivo an . Durch die Suche nach Nematoden-Mutanten, die eine erhöhte Anzahl von toten Zellen zeigen, wurden mehrere für die Phagozytose benötigte Gene identifiziert und genetisch charakterisiert 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .
Ex-vivo- Phagozytose-Assays mit Primärkultur-Phagozyten, im allgemeinen Makrophagen, werden häufig bei Mäusen verwendet. Apoptotische Zellen werden unter Verwendung von Zelllinien wie Jurkat-Zellen hergestellt und mit primären Phagozyten vermischt. Nach einer Inkubation für mehrere Stunden werden die Gesamtzahl der Phagozyten und Verschlingungsphagozyten gezählt, um den Grad der Phagozytose zu bestimmen. Als eine ausgeklügelte Modifikation dieser Methode entwickelte die Nagata-Gruppe einen Ex-vivo- Phagozytose-Assay mit Zellen, die ein Caspase-resistentes ICAD (Inhibitor von Caspase-aktivierter DNase) exprimieren, bei dem apoptotische Zellen keine apoptotische DNA-Fragmentierung erfahren, aber die DNA wird immer noch gespalten Zellen sind phagozytiert. Wenn diese Zellen als apoptotische Targets in einem Phagozytose-Assay verwendet werden, wird nur die DNA von verschlungenen apoptotischen Zellen fragmentiert und durch TdT-vermittelte DUTP-Nick-Etikettierung (TUNEL) gefärbt. Also die leveL des apoptotischen Zellverschlusses wird durch Zählen von TUNEL-Signalen in einer Mischung von Phagozyten und apoptotischen Zellen gemessen 13 .
In D. melanogaster sind professionelle Phagozyten namens Hämocyten, Drosophila Makrophagen, verantwortlich für die Phagozytose von apoptotischen Zellen 14 , 15 . Zusätzlich zu in vitro Phagozytose-Assays mit Kulturzelllinien sind in vivo Phagozytose-Assays mit ganzen Drosophila- Embryonen verfügbar. Drosophila- Embryos sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Niveau der apoptotischen Zellverschlüsselung zu untersuchen, da viele Zellen einer Apoptose unterliegen und durch die Hämocyten während der embryonalen Entwicklung phagozytiert werden 14 , 15 , 16 . Ein Beispiel für einen in vivo Phagozytose-Assay ist die Methode, die von der Gruppe des Franc entwickelt wurde. In ihrer Methode sind die Hämocyten deDurch die Immunfärbung von Peroxidasin, einem Hämozytenmarker, werden die apoptotischen Zellen unter Verwendung des Kernfarbstoffs 7-Aminoaktinomycin D in ganzen Drosophila- Embryonen gefärbt, und die Anzahl der doppelten positiven Zellen wird als ein Signal der Phagozytose 17 gezählt . Ein weiteres Beispiel für einen Phagozytose-Assay auf Embryonen basiert auf dem oben beschriebenen Konzept der Nagata-Methode; In vivo wird jedoch die Phagozytose unter Verwendung der Embryonen von dCAD ( Drosophila caspase-aktivierten DNase) Mutantenfliegen 18 , 19 ausgewertet. Diese in vivo Phagozytose-Assays sind nützlich für die direkte Beobachtung der Phagozytose in situ . Allerdings sind Schwierigkeiten mit dem Ausschluss irgendeiner möglichen Vorspannung in dem Schritt des Zählens von Phagozytosierungszellen verbunden, da es schwierig ist, alle Phagozyten und apoptotischen Zellen in ganzen Embryonen aufgrund ihrer Dicke zu beobachten.
Um diese Einschränkung zu überwinden, entwickeln wirEinen neuen Phagozytose-Assay in Drosophila- Embryonen. In unserer Methode, um leicht phagozytierende Hämocyten zu zählen, werden ganze Embryos homogenisiert, um dispergierte embryonale Zellen herzustellen. Phagozyten werden durch die Immunfärbung eines Phagozytenmarkers nachgewiesen und apoptotische Zellen werden von TUNEL mit diesen dispergierten embryonalen Zellen nachgewiesen. Die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen ermöglicht es uns, in vivo Phagozytose Ebenen zu messen, als ob wir einen in vitro Phagozytose-Assay, dass genau quantifiziert das Niveau der Phagozytose durchgeführt. Alle Genotypen von Fliegen können in diesem Assay angewendet werden, wenn sie sich auf Stufe 16 der Embryos 20 entwickeln , die Entwicklungsstufe, bei der die apoptotische Zellabtrennung durch Phagozytose am häufigsten ist. Diese Methode hat den Vorteil, den Grad der Phagozytose quantitativ zu beurteilen und kann somit zur Identifizierung neuer Moleküle beitragen, die an der Phagozytose von apoptotischen Zellen in vivo beteiligt sind .
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben hierin einen Phagozytose-Assay unter Verwendung von Drosophila- Embryonen beschrieben. Durch die Verwendung von dispergierten embryonalen Zellen zur quantitativen Messung der Phagozytose werden Hämocyten, Drosophila- Profi-Phagozyten für den Hämocytenmarker Croquemort oder srpHemo- getriebenen GFP immunostainiert und apoptotische Zellen werden von TUNEL in diesem Protokoll nachgewiesen. Der Grad der Phagozytose wird als phagozytischer Index ausgedrückt, indem die G…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Kaz Nagaosa und Akiko Shiratsuchi für ihren Rat.
Materials
| whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
| Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
| pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
| Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
| Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
| nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
| Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
| Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
| Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
| Table of Fly Strains | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580 | ||
| Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
| srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
| UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | – |
| UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | – |
Riferimenti
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