अपोपाटोटिक कोशिकाओं के लिए फागोसिटायोसिस परख<em> ड्रोसोफिला</em> भ्रूण
Summary
हम यहां ड्रोसोफिला के फैल चुके भ्रूण कोशिकाओं का उपयोग करते हुए एक फागोसाइटिटिस परख का वर्णन करते हैं। यह हमें वीवो फागोसिस्टोस के स्तरों को आसानी से और सटीक रूप से मापने में सक्षम बनाता है और एपोपोटिक कोशिकाओं के फागोसिटासिस के लिए आवश्यक नए अणुओं की पहचान करता है।
Abstract
एपोपोटिक कोशिकाओं के phagocytosis के आधार पर आणविक तंत्र अधिक प्रतिरक्षा और भड़काऊ असभ्य बीमारियों में अपनी भूमिका के कारण अधिक विस्तार से स्पष्ट किया जाना चाहिए। हमने यहां फॉगोसिटोस की जांच करने के लिए एक प्रायोगिक विधि विकसित की है, जिसमें फल मक्खी ड्रोसोफिला का उपयोग मात्रात्मक है, जिसमें जीन नेटवर्क सिकुड़ना प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए स्तनधारियों से विकासशील रूप से संरक्षित है। ड्रॉसोफिला भ्रूण को पूरे जानवरों का उपयोग करने के लिए सफ़ाई और घूमने वाले फागोसाइट्स को सही तरीके से पहचानने और गिनने के लिए, फॉगोसाइट्स और एपोप्टोोटिक कोशिकाओं सहित फैले हुए कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण को मिला दिया गया। फैलाने वाले भ्रूण कोशिकाओं के उपयोग से हमें विवो फागोसिटासिस के स्तरों को मापने में मदद मिलती है जैसे कि हम इन विट्रो फागोसिटोसिस परख का प्रदर्शन करते हैं जिसमें पूरे भ्रूण में सभी फागोसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं का निरीक्षण किया जा सकता है और फ़ैगोसिटासिस के स्तर को ठीक से निर्धारित किया जा सकता है। हमने पुष्टि की है कि यह पद्धति पिछले अध्ययनों की पुन: प्रजनन करती हैकि एपोपोटिक कोशिकाओं के phagocytosis के लिए आवश्यक जीन की पहचान। इस पद्धति से मृत कोशिकाओं की समाप्ति का विश्लेषण किया जा सकता है, और जब ड्रोसोफिला के शक्तिशाली आनुवंशिकी के साथ मिलकर, फागोसाइट्स द्वारा एपोपोटिक कोशिकाओं के प्रवासन, मान्यता, घुटन और गिरावट के जटिल फ़ैगोसिटिक प्रतिक्रियाओं को प्रकट किया जाएगा।
Introduction
मेटाजोन जानवरों में, जैसे नेमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस , फल उड़ ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर , और चूहों और मनुष्यों, बड़ी संख्या में कोशिकाओं के विकास के दौरान एपोप्टोसिस से गुजरता है ताकि उनके शरीर और वयस्कता में होमियोस्टेसिस 1 , 2 बनाए रख सकें। अपोप्तोटिक कोशिकाओं क्योंकि वे immunogenic intracellular सामग्री को रिहा करता है, तो पूरी तरह से 3 हटाया नहीं द्वारा आसपास के ऊतकों में सूजन प्रेरित तेजी से हटा दिया जाना चाहिए। तेजी से हटाने की सुविधा के लिए, एपोपोटिक कोशिका तथाकथित खाने-मुझे सिग्नल पेश करते हैं जो फागोसाइट्स के सिकुड़न रिसेप्टर्स द्वारा पहचाने जाते हैं, और फागोसिटासिस 3 , 4 , 5 , 6 द्वारा समाप्त हो जाते हैं। इस प्रकार, मेजबान होमियोस्टेसिस के रखरखाव में फागौसाइटोसिस एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इसलिए, मोलेक्यू को स्पष्ट करता है एपोपोटिक कोशिकाओं के फागोसिटायोसिस के अंतर्गत लार तंत्र महत्व का है।
Apoptotic कोशिकाओं के phagocytosis के लिए जिम्मेदार तंत्र नेमेटोड्स, मक्खियों, और चूहों 7 में प्रजातियों के बीच विकासशील रूप से संरक्षित किया जा रहा है। इन मॉडल जानवरों में एपोपोटिक कैंसर की समाप्ति का आकलन करने के लिए वर्तमान में कई फागोसाइटिटिस assays उपलब्ध हैं। सी। एलिगेंस में , 131 दैहिक कोशिकाएं विकास के दौरान क्रमादेशित कोशिका मृत्यु से गुजरती हैं, और कोशिका के शव पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा फागौसाइट हैं, जो गैर-पेशेवर फागोसाइट्स 8 हैं । इस प्रकार, सी में शेष कोशिकाओं की संख्या की संख्या की गणना करना । एलिगेंस विवो में फ़ैगोसाइटोसिस के स्तर को इंगित करते हैं। नेमेटोड म्यूटेंट की खोज के लिए जो मृत कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि दर्शाते हैं, phagocytosis के लिए जरूरी कई जीनों को पहचान लिया गया है और आनुवंशिक रूप से 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12
प्राइमरी कल्चर फागोसाइट्स, आमतौर पर मैक्रोफेज के साथ पूर्व विवो फॅगोसिटासिस एसेज का अक्सर चूहों में उपयोग किया जाता है। अपोपटिक कोशिकाओं को सेल लाइनों जैसे ज़र्कट कोशिकाओं का उपयोग करके तैयार किया जाता है, और प्राथमिक फागोसाइट्स के साथ मिलाया जाता है। कई घंटों के लिए ऊष्मायन के बाद, फागोसाइटिस के स्तर की गणना करने के लिए फागोसाइट्स की कुल संख्या और फ़ैगोसाइट्स को शामिल किया जाता है। इस पद्धति का एक परिष्कृत संशोधन के रूप में, नागाटा के समूह ने एक पूर्व विवो फागोसिटोस परख विकसित किया है, जिसमें कोशिकाएं-प्रतिरोधी आईसीएडी (कस्पेस-सक्रिय डीएनस के अवरोध करनेवाला) को व्यक्त करते हैं, जिसमें एपोपोटिक कोशिकाएं एपोपोटिक डीएनए विखंडन से गुजरती हैं, लेकिन डीएनए अभी भी साफ हो जाता है कोशिकाएं फागॉसिटॉज हैं जब इन कोशिकाओं को एक फागोसाइटिटिस परख के एपोपोटिक लक्ष्य के रूप में उपयोग किया जाता है, तो केवल एपोपोटिक कोशिकाओं में घिरा हुआ डीएनए विखंडित होता है, और टीडीटी-मध्यस्थता वाले डीयूटीपी निक अंत लेबलिंग (ट्यूनेल) द्वारा दाग़ा जाता है। इसलिए, लेवीएपोपोटिक कैल्श की समाप्ति को फागौसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं 13 के मिश्रण में ट्यूनेल संकेतों की गणना के द्वारा मापा जाता है।
डी। मेलानोगस्टर में , हेमोसाइट्स नामित पेशेवर फागोसाइट्स, ड्रोसोफिला मैक्रोफेज, एपोप्टोोटिक कोशिकाओं 14 , 15 के फागोसिटायोसिस के लिए जिम्मेदार हैं। पूरी तरह से ड्रोसोफिला भ्रूण के साथ विवो फागोसिटायोसिस assays में , संस्कृति सेल लाइनों के साथ इन विट्रो फागोसिटाइसेस assays में उपलब्ध हैं। ड्रोसोफिला भ्रूण एपोपोटिक सेल की समाप्ति के स्तर की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है क्योंकि कई कोशिकाएं एपोपोटिकिस से गुज़रती हैं और भ्रूण के विकास के दौरान हेमोसाइट्स द्वारा phagocytosed हैं 14 , 15 , 16 । विवो फागोसिटोसिस परख का एक उदाहरण फ़्रैंक समूह द्वारा विकसित विधि है। उनके विधि में, हीमोसाइट्स डी हैंपेरोक्साइडिस के प्रतिरक्षण द्वारा, एक हीमोसाइट मार्कर, एपोपोटिक कोशिकाएं पूरे ड्रोसोफिला भ्रूण में परमाणु डाई, 7-एमिनो एक्टिनोमायसीन डी का उपयोग करके दागिल हैं, और दोहरा सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या को फागोसिटायसिस 17 के संकेत के रूप में गिना जाता है। भ्रूण पर फ़ैगोसिटायस परख का एक और उदाहरण ऊपर वर्णित नागता की पद्धति पर आधारित है; हालांकि, vivo phagocytosis में डीसीएडी के भ्रूण ( ड्रोसोफिला कस्पेस सक्रिय DNase) उत्परिवर्ती मक्खियों 18 , 1 9 का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है। विवो फागोसाइटिटिस assays में यह सीटू में सीधे phagocytosis देखने के लिए उपयोगी होते हैं। हालांकि, कठिनाई फ़ैगोसिटॉसिंग कोशिकाओं की गिनती के चरण में किसी भी संभावित पूर्वाग्रह को छोड़कर जुड़ी हुई हैं क्योंकि इसकी पूरी मोटाई के कारण पूरे भ्रूण में सभी फागोसाइट्स और एपोपोटिक कोशिकाओं का पालन करना कठिन है।
इस सीमा को पार करने के लिए, हम विकास करते हैंड्रोसोफिला भ्रूण में एक नई phagocytosis परख एड हमारे विधि में, आसानी से फामोसिटॉसिंग हेमोसाइट्स की गिनती करने के लिए, पूरे भ्रूण को फैलाने वाले भ्रूण कोशिकाओं को तैयार करने के लिए तैयार किया गया है। Phagocytes एक phagocyte मार्कर के immunostaining द्वारा पता लगाया जाता है, और apoptotic कोशिकाओं इन छितरी हुई भ्रूण कोशिकाओं के साथ TUNEL द्वारा पता लगाया जाता है। फैलाने वाले भ्रूण कोशिकाओं के उपयोग से हमें विवो फागोसिटोसिस के स्तरों को मापने में मदद मिलती है जैसे कि हम में इन विट्रो फागोसिटोसिस परख का प्रदर्शन किया है जो कि वास्तव में फागोसिटासिस के स्तर को बढ़ाता है। मक्खियों के सभी जीनोटाइप इस परख में नियोजित किया जा सकता है यदि वे भ्रूण 20 के चरण 16 को विकसित करते हैं, तो विकासात्मक चरण जिस पर phagocytosis द्वारा apoptotic सेल निकासी सबसे प्रचुर मात्रा में है। इस पद्धति में phagocytosis के मात्रा का आकलन करने का लाभ होता है, और, इस प्रकार, विवो में एपोपोटिक कोशिकाओं के phagocytosis में शामिल नए अणुओं की पहचान में योगदान दे सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ ड्रोसोफिला भ्रूण का उपयोग कर एक फागोसिटास परख का वर्णन करते हैं। Phagocytosis को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए फैलाने वाले भ्रूणीय कोशिकाओं का उपयोग करके, हेमोसाइट्स, ड्रोसोफिला पेशेवर फाग?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
उनकी सलाह के लिए हम कज़ नागासा और अकीको शिरात्सुची के आभारी हैं
Materials
| whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
| Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
| pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
| Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
| Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
| nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
| Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
| Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
| Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
| Table of Fly Strains | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580 | ||
| Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
| srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
| UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | – |
| UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | – |
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